التعبير عن البروتينات الفلورية في السهيم من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في

نحن التقرير هنا التعبير القوي والفعال للالبروتينات الفلورية بعد حقن مرنا في البويضات غير المخصبة من السهيم. فإن تطوير تقنية حقن مكروي في هذا حبلي القاعدية يمهد الطريق لبعيدة المدى الابتكارات التقنية في هذا النظام النموذجي الناشئة، بما في ذلك في مجال التصوير فيفو والتلاعب الجينات المحددة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال mRNA ، وترميز بروتين الفلورسنت في بويضات الشعب الهوائية الفغرة اللاتينية للسماح بالتصوير الفلوري في الجسم الحي للأجنة النامية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إحداث تفريخ amfi ais الناضجة ، من الذكور والإناث عن طريق صدمة درجة حرارة لمدة 24 ساعة. بعد صدمة درجة الحرارة ، يتم وضع الإناث والذكور في أكواب تفريخ فردية ، مما يسمح بجمع البويضات المنوية على التوالي.

بمجرد اصطفاف السيات في طبق مطلي بالبولييسين ، يتم استخدام إبرة الحقن المجهري المعدة خصيصا لحقن المحلول داخل قلب السيل. الخطوة الأخيرة هي إخصاب الخلية بقطرة إلى خمس قطرات من المنوية. في النهاية اثنين من الفوتون المسح الضوئي بالليزر.

يستخدم الفحص المجهري لإظهار التعبير في كل مكان للبروتينات الفلورية المنتجة من الحمض النووي الريبي المرسال المحقون الدقيق. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات الحقن المجهري لأن المهارات التقنية المطلوبة التي يستحيل تفصيلها وتغطيتها في الطباعة. للبدء ، قم بإعداد الأطباق المطلية بالبولي ليسين المستخدمة لشل حركة الخلايا أثناء الحقن.

لكل طبق بتري لزراعة الخلايا 35 ملم ، قم بتغطية الجزء السفلي بمحلول البولي ليسين واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، انقل محلول البوليليسين إلى طبق آخر ومرة أخرى ، احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تخلص من المحلول واترك أطباق بتري تجف رأسا على عقب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

عندما تجف ، قم بتخزين الأطباق المطلية ملفوفة في غلاف بلاستيكي عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. لتحضير الأطباق المطلية ب aros المستخدمة في زراعة الأجنة المحقونة ، قم بعمل مياه البحر الاصطناعية ومياه التناضح العكسي. بعد ذلك ، قم بإذابة aros بتركيز 1٪ في SW المصفى بسرعة سكب محلول aros الدافئ من طبق بتري إلى آخر لضمان طلاء أروس رقيق جدا للطبق.

غلفي الأطباق المغلفة في لفائف ساران واحفظيها على حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. أولا ، قم بإعداد مزيج الحقن في الحمض النووي الريبي وفينول الماء الخالي من الحمض النووي. اللون الأحمر للمحلول ويسمح بتحديد الأجنة المحقونة بنجاح.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمزيج لحبيبات البلورات والاحتفاظ بها على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام. عندما تصبح جاهزا ، قم بتحميل ماصة سعة 10 ميكرولتر مع 0.5 ميكرولتر من مزيج الحقن ، وتجنب الجزء السفلي من الأنبوب حيث تم تكوير البلورات. قم بإعادة ملء إبرة الحقن عن طريق سحب قطرة الحقن 0.5 ميكرولتر.

تخلط في فتحة الإبرة الكبيرة. تحضير إبرتين في حالة كسر إحداهما أثناء الحقن. قم بتخزين الإبر في وعاء به ماء في الأسفل لمنع تبخر الحقن.

تخلط وتوضع على أربع درجات مئوية. دع مزيج الحقن ينتقل ببطء إلى طرف إبرة الحقن لمدة ساعة واحدة على الأقل لتقليل تكوين الفقاعات. لبدء جمع البويضات المنوية ، يصاب الذكور والإناث بالصدمة في SW لمدة 24 ساعة ثم يتم نقلهم إلى أكواب فردية قبل ساعة إلى ساعتين من التفريخ.

عند التفريخ ، اجمع المنوية والخلايا على الفور. احرص على عدم إذهال البالغين أثناء التجميع. يمكن أن تتبدد الحركة الإضافية وبالتالي تضعف كل من المنوية والخلايا بعد جمعها.

احتفظ بالحيوانات المنوية على الجليد في أنبوب سعة 1.5 مل وانقل الخلايا في SW المصفى إلى أطباق بتري المغسولة مسبقا. نقل 100 إلى 500 cytes إلى طبق بتري آخر 35 ملم لإجراء الحقن. أخيرا ، قم بتخصيب ما تبقى من قابض الخلايا كعنصر تحكم في جودة المنوية والخلايا أو لتجارب أخرى.

لبدء إجراء الحقن ، قم بتثبيت الإبرة على المعالج الصغير بزاوية 50 درجة بالنسبة للمستوى الأفقي تحت نطاق تشريح الفلورسنت مع 25 عينية سابقة ، ونقل 30 صوتا إلى طبق مطلي بالبولي يسين وتصفية SW للمساعدة في تتبع الخلايا المحقونة. قم بإيداعها على طول الخط بطريقة مرتبة. قم دائما بحقن أعداد صغيرة لتقليل التعرض.

حان الوقت للبوليسين ، الذي يميل إلى تشويه الأجنة النامية. استخدم إضاءة المجال المظلم لجعل الصوارات شفافة قدر الإمكان. ثم باستخدام مقبض الحركة الخشنة ، اجعل إبرة الحقن قريبة من خلية ملقط دقيقة. قص.

افتح الإبرة عند المستوى الذي يبدأ فيه الطرف في الانحناء عن طريق النبض مع الحاقن. تحقق من تدفق مزيج الحقن الأحمر من الإبرة بتكبير 200 ×. وباستخدام مقبض الحركة الدقيقة ، حرك إبرة الحقن برفق داخل قلب السرية.

إذا تم إدخاله بشكل سطحي ، فلن يبقى المحلول المحقون داخل موقع UO. إذا تم إدخاله بعيدا جدا ، تدمير موقع UO. حقن بواحد إلى ثلاث نبضات.

إذا كانت الإبرة جيدة بما فيه الكفاية ، فقم بالحقن بتدفق مستمر عند ضغط ثابت. تأكد من أن حجم الحقن يتوافق مع خمس إلى ثلث حجم البويضة الواحدة بعد الحقن. اسحب الإبرة للخارج بسرعة لتجنب التسرب.

تحقق من بقاء المحلول المحقون داخل الخلية وأنه بعد بضع ثوان ، ينتشر المحلول المحقون في جميع أنحاء السرية. انتقل إلى اللوحة التالية في الطابور. احتفظ ببعض الأجنة المحقونة من كل سلسلة كعناصر تحكم سلبية لتقدير مضان الخلفية عند المسح بحثا عن الأجنة المحقونة لتخصيب البويضات بمجرد حقن السلسلة.

نظرا لأن جودة البويضات تنخفض بمرور الوقت ، قم بحقن الخلايا وتخصيبها في غضون ساعة واحدة. بعد التفريخ. اعتمادا على تركيز المنوية ، أضف قطرة إلى خمس قطرات من المنوية إلى UY وقم بتدوير الطبق.

يجب أن يظهر غلاف الإخصاب على الأجنة. بعد حوالي دقيقة واحدة ، اسمح للأجنة بالانفصال عن الطبق المغطى بالبولي ليسين أثناء حقن سلسلة أخرى من البويضات. بمجرد فصلها ، انقل الأجنة إلى طبق بتري مغطى بأروس.

قم بإزالة الأجنة من الطبق المغطى بالبولي ليسين إن أمكن. قبل مرحلة الخليتين. في مرحلة الخليتين إلى أربع خلايا ، حدد الأجنة المحقونة بنجاح بمساعدة نطاق تشريح الفلورسنت.

باستخدام مرشح DSR ، يشار إلى الحقن الناجح من خلال التشكل الطبيعي الذي يعرض إشارة فلورية حمراء مشتقة من الفينول الأحمر. احتفظ بالأجنة وتصفية SW في أطباق بتري المغلفة بالزراعة عند 19 درجة مئوية حتى المرحلة المرغوبة للتصوير في الجسم الحي ، تم التقاط هذه الصور التمثيلية لأجنة bronchos stoma lancia lato بعد الحقن المجهري ل mRNAs وطلاء البروتينات الفلورية. توضح هذه الصورة الأولى أن التعبير عن EGFP النووي الذي تم الحصول عليه عن طريق الحقن المجهري لبناء H two B-E-G-F-P يمكن اكتشافه في الأجنة في وقت مبكر من مرحلة الخلية ال 16.

يعد جنين المرحلة المعدية هذا مثالا على التعبير المشترك في كل مكان عن الكرز النووي والغشاء المستهدف EGFP. تنتج الإشارة النووية عن الحقن المجهري لبناء الكرز H two BM بينما يتم الحصول على التألق في أغشية الخلايا عن طريق الحقن الدقيق لبناء صندوق EEG FP CAAX. يوضح القسم البصري من جنين المرحلة المعدية هذا كيف يتم تمييز النوى والخطوط العريضة للخلايا على التوالي بواسطة mCherry المستهدف نووي وEGFP المرتبط بالغشاء.

سيدعم العرض المرئي لتقنية الحقن المجهري هذه الباحثين في التطور التطوري لمجتمع علم الأحياء لتحسين الأساليب الحالية وتطوير مناهج جديدة للتصوير الفردي ، والتلاعب الجيني المحدد والاستقرار في AFI ، وهو نموذج مهم لفهم تطور.