خيارات نيون في الموقع بروتوكول التهجين لXist RNA جنبا إلى جنب مع المناعي من هيستون تعديل في كروموسوم X-التعطيل

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في ديناميكيات عدم الترميز الطويل ، والحمض النووي الريبي ، والتعديل اللاجيني المرتبط به أثناء تعطيل الكروموسوم X باستخدام تهجين فلوري سريع في الموقع جنبا إلى جنب مع التألق المناعي. يتطلب هذا البروتوكول تحضير السيتوزين للشرائح مع خلايا جسم الجنين المتباينة ، والتي تتخلل ثم يتم تثبيتها للتلطيخ. علامة الفلورسنت التالية المترجمة بواسطة جسم مضاد للهيستون H ثلاثة ثلاثي ميثيل ليسين 27 تتراكم على كروموسوم X غير النشط.

تستخدم الخطوة الأخيرة مجسات قليل النوكليوتيدات التي تحتوي على خمسة تعديلات أمينية أولية ويتم تصنيفها بمتوسط الفلوروفور التفاعلي AM لأداء الوجود. أسماك الحمض النووي الريبي. في نهاية المطاف ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري لإظهار توطين سحابة الحمض النووي الريبي الموجودة وتعديل الهيستون أثناء تمايز خلايا E ES.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أننا نستخدم العديد من قليل النوكليوتيدات الفريدة ، والتي يتم تصنيفها بأربعة فلورو واحد. يوفر لنا هذا اكتشافا محددا للعبور ، مما يقلل من الخلفية ، وهذا يزيد أيضا من تغلغل النواة ويزيد أو يعزز شدة الإشارات. بالإضافة إلى ذلك ، عندما نزيد تركيز المجسات ، يمكننا تقليل الوقت اللازم لإكمال تجربة الأسماك المناعية هذه بشكل كبير.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتوطين RA الموجود على الكروموسوم السابق غير النشط وتعديل الكروموسوم المرتبط به. يمكن تطبيقه أيضا على الأنظمة البيولوجية الأخرى للكشف عن RAs وما يرتبط به من تعديل لاجيني ، وتوطين نووي ، وتنظيم عبر الأجيال. لتحضير المجسات أولا ، احصل على أوليغوس متعدد بطول 20 إلى 30 نيوكليوتيدات بدرجة حرارة انصهار تتراوح من 63 إلى 65 درجة مئوية ، والتي تحتوي على تسلسل فريد مضاد للمعنى لوجود RNA وخمسة تعديل أميني أولي.

قم بتعليق هذه oligos في كميات متساوية المولار لتجمع المياه النقية من oligos المختلفة ليصبح المجموع 4.5 ميكروغرام من الحمض النووي. ثم باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، قم بتسمية oligos بصبغة الفلورسنت التفاعلية am بعد وضع العلامات على oligos. مررها عبر عمود G 25.

ثم باستخدام الإيثانول وخلات الصوديوم ، قم بترسيب oligos. يتطلب ذلك فترة نصف ساعة عند سالب 80 درجة مئوية قبل أن تدور 21,000 جم عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام 70٪ من الإيثانول بعد الغسيل.

Resus بتعليق oligos في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز أو tris EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار من الحمض النووي. هذا يجعل حل مخزون المسبار لاستخدام المسبار يعيد تركيزه إلى 250 نانو مولار في مخزن التهجين. للبدء ، قم بتمييز الخلايا ES أو EB التي تنمو في ستة أطباق جيدة ، واستنشق وسط الثقافة من الآبار ثم اغسل الخلايا بدرجة حرارة الغرفة.

تستنشق PBS بدقة PBS. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من محلول التربسين إلى كل بئر واحتضن الطبق لمدة خمس إلى 10 دقائق. أوقف تفاعل التريبسين عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من الوسائط إلى كل بئر وسحب ماصاتها برفق.

ثم انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل. الآن قم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 200 Gs في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة كل المادة الطافية وإعادة تعليق منصة الخلايا في ملليلترين من PBS. ثم عد الخلايا وتخفيف التعليق إلى 400 ، 000 خلية لكل مليلتر في PBS.

الآن ، قم بتجميع كل شريحة باستخدام بطاقة تصفية وغرفة ومقطع. اصنع أكبر عدد ممكن من الأشياء ووضعها في دوار دوران سيتو. أضف 250 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى كل شريحة وقم بتدوير الشرائح بسرعة 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم بيرمي وإصلاح. أولا ، انقل الشرائح بسرعة إلى PBS المثلج لمدة خمس دقائق كخطوة شطف. ثانيا ، انقل الشرائح إلى المخزن المؤقت CSK البارد لمدة دقيقة واحدة لتضخيم الثالث، انقل الشرائح إلى المخزن المؤقت CSKT لمدة خمس دقائق لاختراق الخلايا.

رابعا ، اغسل الخلايا في عازلة CSK المثلجة لمدة دقيقة. وأخيرا ، قم بإصلاحها في درجة حرارة الغرفة 4٪ ألدهيد بارافورم في PBS لمدة 10 دقائق. أولا ، قم بإزالة الشرائح من محلول PFA.

ثم انقلها إلى برطمان مشترك مع PBST لعدة ثوان ، متبوعا بوضعها على ميل لتصريفها. بعد ذلك، قم بتحميل صندوق طرف ماصة فارغ بالماء أسفل ملحق حامل الطرف. ثم امسح الجوانب الخلفية للشرائح وانقلها إلى هذا الصندوق.

الآن قم بتراكب كل شريحة ب 40 ميكرولتر من محلول الحجب وقم بتغطية الشرائح برفق بزلات غطاء. دعهم يحتضنون في الصندوق لمدة 10 دقائق على المقعد. ثم قم بإزالة زلات الغطاء وقم بتعيين الشرائح على مائل.

أضف الآن 40 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الأساسي. استبدل زلات الغطاء واترك الشرائح تحتضن على المقعد لمدة 30 دقيقة بعد نصف ساعة. قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة عن طريق غسل الشرائح مرتين في PBST في برطمانات coplan.

استخدم رج لطيف واترك كل غسلة لمدة خمس دقائق. ثم أعد الشرائح إلى ميل واترك PBST يستنزف. اتبع ذلك بمسح المحلول الزائد من مؤخرة الشريحة ثم إعادة الشرائح إلى الصندوق.

الآن ضع 40 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الثانوي إلى 500 على كل شريحة. قم بتغطية الشرائح بزلات الغطاء واتركها تحتضن على المقعد لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء للمضي قدما. يجب دائما حماية الشرائح من الضوء.

قم بإزالة الأجسام المضادة باستخدام PBST كما كان من قبل ، ثم اضبط الشرائح على ميل لتصريفها. عند إجراء التألق المناعي ، قم بتسخين صندوق يحتوي على الماء إلى 37 درجة مئوية. بعد مسح عازلة الغسيل من مؤخرة المنزلقة ، ضعها في صندوق طرف ماصة مع ماء بدرجة حرارة وقم بتطبيق 500 ميكرولتر من محلول غسيل الأسماك على كل شريحة.

دعهم يحتضنون لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بشفط المحلول من الشرائح المجاورة لكل شريحة عند ثمانية ميكرولترات من مسبار العمل في درجة حرارة الغرفة وقم بتطبيق زلة غطاء. الآن انقل الشرائح إلى صندوق الشرائح الدافئ واحتضنها لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، اغسلي الشرائح في مخزن مؤقت لغسل الأسماك في وعاء مشترك عند 37 درجة مئوية. عندما ينزلق الغطاء ، والذي يستغرق عادة بضع دقائق ، قم بإزالة زلات الغطاء واترك الشرائح تحتضن لمدة خمس دقائق. ثم انقل الشرائح إلى برطمان يحتوي على مخزن مؤقت لغسل الأسماك مع 0.5 نانوجرام من البقعة الرقيقة لكل مليلتر ، أيضا عند 37 درجة مئوية.

دع الشرائح تحتضن في هذا المحلول لمدة خمس دقائق. الآن اغسل الشريحة في اثنين من XSSC خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. للإنهاء ، اضبط الشرائح على استنزاف مائل يزيد عن اثنين من XSSC.

امسحها وقم بتثبيتها بأربعة ميكرولترات من محلول أنتيفا الذي يحتوي على نقطة في البوصة. تم استخدام الأسماك المناعية السريعة لمراقبة توطين الحمض النووي الريبي الموجود وتعديل الهيستون. في التمايز بين الخلايا الإناثية EB الموجودة ، يبدو الحمض النووي الريبي وكأنه سحابة خضراء تغطي كامل طول الكروموسوم X المعطل في هذه الخلايا ، يتم تصور تعديل هيستون H ثلاثة ثلاثي ميثيل ليسين 27 باللون الأحمر ويتم وضع النوى بواسطة DPI باللون الأزرق.

تمت معالجة خلايا EB الأنثوية المتمايزة في اليوم 12 من التمايز. في هذا الوقت ، أظهرت أكثر من 90٪ من الخلايا وجود سحابة في الخلايا كانت مجسات قليل النوكليوتيدات القصيرة قادرة على الاختراق بكفاءة مما أدى إلى تلطيخ جميع إشارات هيستون H الثلاث ثلاثي ميثيل ليسين 27 تقريبا مع وجود سحب الحمض النووي الريبي في 150 نواة ، تم العثور على 97٪ من إشارات الحمض النووي الريبي الموجودة لتتمركز مع هذه الهستونات الميثيلية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من خمس ساعات لإكمال التحضير الطفيف.

التألق المناعي المناعي له هو ثلاثة أشهر في 27 ويوجد التهاب المفاصل الروماتويدي. إذا قمنا بأدائنا بشكل صحيح ، فيمكن تطبيق بروتوكول الأسماك المناعية هذا على التعديلات اللاجينية الأخرى للحمض النووي الريبي والبروتينات ذات الأهمية. من أجل تطبيق هذا البروتوكول على نظام بيولوجي مختلف ، قد تحتاج إلى بعض التحسين. حظا سعيدا في تجاربك.