تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة إعادة تشكيل النظام الليزوزومي النهائي بواسطة البكتيريا داخل الخلايا باستخدام الجسيمات النانوية الفلورية كمتتبعات. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع خلايا الهيلا أولا في شريحة من ثماني غرف آبار واحتضانها طوال الليل. الخطوة الثانية هي إصابة الخلايا بالسالمونيلا والتاريكا.

بعد ذلك ، يتم إجراء وضع العلامات على مطاردة النبض للخلايا المضيفة المصابة عن طريق الحضانة باستخدام جزيئات الروم النانوية BSA الذهبية. الخطوة الأخيرة هي مراقبة التغيرات في نظام الجوم الداخلي للخلية المضيفة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. في النهاية ، يتم إجراء القياس الكمي للتوزيع داخل الخلايا للجسيمات النانوية باستخدام حزمة برامج MRS.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل المجهر المناعي ، هي أن الخلايا المصابة يتم تحليلها بالطريقة ، يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لنمط الحياة داخل الخلايا من تيريكا. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا على مسببات الأمراض الأخرى داخل الخلايا مثل أنواع Gaia أو Ella Prolia أو المتفطرة السلية. يمكن تطبيقه أيضا على أنواع الخلايا المضيفة الأخرى مثل micro feh أو خطوط الخلايا أو الخلايا الأولية.

يتطلب تخليق جزيئات نانو الذهب 10 نانومتر أو NPS حلين محلول A ومحلول B.To تحضير المحلول A ، إضافة ملليلترين من كلوريد الذهب المائي بنسبة 1٪ إلى 160 مل من ماء مللي كيو. تحضير المحلول B عن طريق إضافة ثمانية ملليلتر من 1٪ ثلاثي سترات ثنائي هيدرات ، و 160 ميكرولتر من حمض التانيك 1٪ في 32 مل من ماء مللي كيو. قم بتسخين المحاليل A و B إلى 60 درجة مئوية ثم اخلطيها أثناء التحريك.

يجب ملاحظة اللون الأزرق الداكن مباشرة بعد حوالي 15 دقيقة. يجب أن يصبح المحلول أحمر اللون في هذه المرحلة. سخني المحلول إلى 95 درجة مئوية.

احتفظ بها عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد القطعة الذهبية للطلاء ووضع العلامات عن طريق إضافة 900 ميكرولتر من MPS الذهبي إلى أنبوب einor سعة 1.5 مليلتر والطرد المركزي عند 15،000 Gs لمدة 30 دقيقة. تخلص من المادة الطافية الحبيبات في 900 ميكرولتر من ماء MQ المعقم.

أضف 100 ميكرولتر من محلول BSA واخلطه على دوامة بسرعة 800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة BSA الزائد عن طريق الطرد المركزي للمستحضر عند 15،000 Gs لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الذهب BSA NPS و 125 ميكرولتر من PBS.

أضف 12.5 ميكرولتر من بيكربونات المولار. يتم تحضير محلول R domine n hydroxy CIN أو محلول NHS في DMSO مباشرة قبل. استخدم 15 ميكرولترا من محلول R DOMINE N-H-S-D-M-S-O إلى 0.5 مل من نظام التعليق الذهبي BSA NP.

احتضان التفاعل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أثناء الخلط عند 800 دورة في الدقيقة وتجنب التعرض للضوء. بعد ذلك ، قم بتنقية الذهب BSA rumine NPS من خلال غسيل الكلى ضد PBS عند أربع درجات مئوية مع خمسة تغييرات في العازلة على مدى 36 إلى 48 ساعة بعد التنقية ، وتثبيت NPS عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من B-S-A-P-B-S إلى كل مليلتر واحد من الذهب BSA RUMINE NPS لإزالة جهاز الطرد المركزي BSA Rumine الحر أو الذي تم إطلاقه عند 15 ، 000 GS لمدة 16 دقيقة عند أربع درجات مئوية. يقوم Resus بتعليق الحبيبات بملليغرامين لكل ملليلتر من B-S-A-P-B-S بعد قياس الكثافة الضوئية عند 520 نانومتر أو OD خمسة 20.

قم بتخزين الذهب BSA رود Domine NPS عند أربع درجات مئوية ، وتجنب التعرض للضوء ، حيث تعبر خلايا هذه التجربة بشكل دائم عن بروتين فلوري أخضر موسوم مصباح البروتين السكري الليزوزومي واحد GFP ويتم زراعتها في DMEM مع مصل عجل الجنين 10٪ عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ بذور ثاني أكسيد الكربون الخلايا بكثافة 50 ، 000 لكل بئر في شريحة من ثماني غرف آبار واحتضانها طوال الليل. البكتيريا التي تصيب خلايا هيلا هي مسببات الأمراض المعدية المعوية البشرية والسالمونيلا والتاريكا. للمقارنة ، يتم استخدام سلالتين متحولتين.

تحتوي جميع السلالات الثلاث على بلازميد للتعبير التأسيسي عن GFP المعزز ويتم زراعتها في مرق LB مع المضادات الحيوية المناسبة للحفاظ على البلازميدات لكل سلالة. تلقيح مستعمرة واحدة من البكتيريا في ثلاثة ملليلتر من مرق LB بالمضاد الحيوي المناسب وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في ظل ظروف الاهتزاز للتهوية في اليوم التالي ، قم بتخفيف كل ثقافة من واحد إلى 31 في مرق LB الطازج واستمر في النمو لمدة ثلاث ساعات ونصف.

لبدء هذا الإجراء ، قم بقياس OD 600 من بكتيريا الزراعة الفرعية وقم بتخفيفه إلى OD 600 من 0.2. في مليلتر واحد من PBS ، أضف كميات مناسبة من البكتيريا إلى خلايا هيلا في شريحة الغرفة A 12 لتحقيق تعدد العدوى 100. احتضن لمدة 30 دقيقة في حاضنة الخلية.

اغسل خلايا هيلا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة البكتيريا غير الداخلية. يتم تعيين هذه النقطة الزمنية على أنها ساعة الصفر بعد الإصابة أو نقطة الصفر في الساعة. أضف 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج الذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين إلى الخلايا واحتفظ به لمدة ساعة واحدة.

بعد ساعة واحدة. استبدل الوسط بوسيط تصوير يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين. أضف الذهب BSA الكرم NPS إلى خلايا hela للحصول على تركيز نهائي من OD خمسة 20 من 0.1.

احتضن لمدة ساعة بعد ساعة واحدة. قم بإزالة الوسيط واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. أخيرا ، أضف 300 ميكرولتر من وسط التصوير الطازج الذي يحتوي على 10٪ FCS و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين.

بالنسبة لبقية وقت الحضانة ، يتم إجراء تصوير عالي الدقة للخلايا في نقاط زمنية مختلفة باستخدام نظام تصوير متحد البؤر مثل المسح بالليزر متحد البؤر أو مجهر القرص الدوار مع مفتاح غرفة البيئة المرطبة على نظام التحكم في درجة الحرارة والانتظار حتى يصبح مستقرا. قم بتحسين إعدادات التصوير مثل مسح التكبير ودقة السرعة وحجم الخطوة Z. استخدم إعدادات انبعاث الإثارة المناسبة ل GFP و BSA الخام الذهبي NPS في النقاط الزمنية المحددة بعد الإصابة.

قم بتركيب الشريحة المكونة من 12 غرفة التي تحتوي على خلايا مصابة على مرحلة المجهر وسجل الصور لتحليل الصور ودراسة إعادة تشكيل الجهاز الداخلي بواسطة السالمونيلا داخل الخلايا. استخدم برنامج تحليل الصور. افتح البيانات بالنقر فوق فتح واختيار الملف في شريط أدوات الكائنات في طريقة العرض التجاوزية.

انقر فوق الرمز لإضافة عنصر سطح جديد لتحليل منطقة اهتمام أو عائد استثمار، حدد تقسيم منطقة اهتمام فقط، ثم انقر على التالي كقناة مصدر. حدد القناة الثالثة.

تحقق من الخيار السلس لإعداد نعومة المنطقة الناتجة. حدد قيمة يدويا أو اقبل القيمة التي تم إنشاؤها تلقائيا. للعتبة.

حدد خيار الكثافة المطلقة لضبط الحد. حدد الخيار اليدوي وقم بتعيين قيمة في منطقة العرض. يتم عرض معاينة عتبة السطح باللون الرمادي.

انقر فوق التالي على علامة التبويب يصنف الأسطح. يمكن تصفية السطح الناتج وفقا لمعايير مختلفة. المرشح الافتراضي هو عدد فتحات V أكبر من 10 عوامل تصفية أخرى يمكن أيضا تضمينها بالنقر فوق إضافة.

في هذا المثال، يتم استخدام عامل التصفية الافتراضي لإكمال إنشاء السطح. انقر فوق إنهاء في قائمة الكائنات. قم بإلغاء تحديد المربع الخاص بوحدة تخزين العنصر.

يتم الآن عرض سطح جديد تم إنشاؤه في منطقة العرض. باللون الأحمر ، قم بتصدير الإحصائيات إلى ملف Excel بالنقر فوق حفظ. كانت NPS الذهبية التي تم تصنيعها بواسطة هذا البروتوكول شبه كروية الشكل وحجمها حوالي 10 نانومتر.

لم يؤثر طلاء BSA ووضع العلامات على rho domine على مورفولوجيتها أو حجمها. لدراسة إعادة تشكيل الجهاز الداخلي الخلوي المضيف بواسطة السالمونيلا داخل الخلايا. كانت خلايا هيلا وهمية مصابة أو مصابة بالسالمونيلا من النوع البري أو سلالتين متحولتين ، والنبض مطاردا بذهب 10 نانومتر.

قضيب BSA دومين ن البازلاء في الخلايا غير المصابة ، يتم توزيع NPS بشكل موحد في الجسيمات الداخلية المتأخرة أو الجسيمات الحالة. في المقابل ، أعيد ترتيب NPS في الخلايا المصابة بالسالمونيلا من النوع البري إلى حد كبير بعد ثماني ساعات من الإصابة. تم تشكيل شبكة مستقرة من الخيوط أو الخيال الناجمة عن السالمونيلا ، وتم العثور على معظم أعضاء البرلمان متراكمة داخل الهياكل الأنبوبية.

أظهرت السلالات الطافرة سلوكيات مميزة بعد ثماني ساعات من الإصابة. كانت سلالة SSAV الطافرة محصورة داخل السالمونيلا التي تحتوي على VAE أو SCV. على الرغم من عدم تشكيل غربلة ، إلا أن غالبية أعضاء البرلمان كانوا لا يزالون موجودين في الجسيمات الداخلية المتأخرة الحرة أو الجسيمات الحالة للسيف.

حدث هروب سلالة متحولة من السالمونيلا إلى السيتوبلازم ولم يلاحظ أي ارتباط بين NPS والبكتيريا. عندما تم فحص إمكانية الوصول إلى النظام الليزوزومي النهائي في مراحل مختلفة من عدوى السالمونيلا ، أظهرت النتائج أنه في جميع الحالات ، تراكمت معظم NPS الداخلية في SCV أو SIFs بعد هذا الإجراء. طرق أخرى ، يمكن إجراء نقل الرقبة المجهري.

قد يجيب هذا على أسئلة إضافية مثل البنية الفائقة أو مقصورات الغشاء في بعض الخلايا المضيفة المصابة بالنانو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الجسيمات النانوية الفلورية. يمكن استخدامها لتسمية مقصورات المضيف المعدلة بواسطة السالمونيلا داخل الخلايا.