تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تركيز الفيروس من خلال القياس الكمي للمتغير المعدي عن طريق حساب اللويحات المنفصلة في زراعة الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق خلايا الطلاء الأولى لتشكيل طبقة أحادية متجمعة للعدوى. الخطوة الثانية هي إجراء التخفيف التسلسلي للعينة الفيروسية المجهولة ليتم قياسها كميا.

بعد ذلك ، تصاب الطبقات الأحادية المتقاربة باستخدام التخفيف التسلسلي للمخزون الفيروسي ، متبوعا بتطبيق تراكب شل الحركة. الخطوة الأخيرة هي إصلاح اللويحات وصخها بعد وقت الحضانة المناسب للفيروس المعني من أجل عد اللويحات السرية. في النهاية ، يمكن استخدام فحوصات البلاك وتعديلها بعدة طرق مختلفة من أجل تحديد العيار الفيروسي لعينة فيروسية غير معروفة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التراكب شبه الصلب ، هي أن التطبيق والإزالة أبسط بكثير في كل من الإنتاجية العالية والتطبيقات التقليدية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يلزم تسخين الكواشف. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى البحث عن العديد من الفيروسات اللايتية المختلفة مثل استخدام تراكب سائل.

في شكل 96 بئر يسمح بالفحص السريع للمركبات العلاجية الجديدة ، والتي يمكن أن تقلل بشكل كبير من الساعات الطويلة التي تقضيها في المختبر لإجراء فحوصات البلاك التقليدية في اليوم السابق للوحة الفحص ، الخلايا المناسبة للفيروس المعني من أجل تحقيق 90 إلى 100٪ من الطلاقة المشتركة في يوم الإصابة. يمكن أيضا تحضير محاليل المخزون في اليوم السابق للفحص أولا لتحضير محلول تثبيت بنسبة 10٪ فورمالديهايد في الماء المقطر عن طريق خلط 5.56 مل من 36٪ فورمالديهايد مع 14.44 مل من الماء المقطر. ثم تحضير صبغة البنفسج الكريستالية المكونة من 1٪ بنفسجي بلوري في 20٪ إيثانول مخفف بالماء المقطر.

بعد ذلك ، أثناء العمل في ظل ظروف معقمة ، قم بإعداد وسائط البلاك المناسبة لنوع الخلايا المستخدمة. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرون إذا لم يكن أي من الكواشف معقما. لتحضير تراكب سائل لاستخدامه في فحص البلاك عند 2.4 جرام من خلية avy إلى قارورة تحتوي على 97.6 مل من الماء المقطر الذي يختلط بسرعة مع شريط التقليب.

اخلطي المحلول في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح لزجا جدا بالنسبة لشريط التقليب. في هذه المرحلة ، انقل القارورة إلى شاكر قارورة وقم بتحريكها بشدة لمدة 30 دقيقة لضمان التجانس المتساوي. أخيرا ، قم بتعقيم المحلول عند 121 درجة مئوية عند 14 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة.

وعند انتهاء البرنامج ، قم بتخزينها محكمة الغلق في درجة حرارة الغرفة لتراكب aros. تحضير محلول مخزون زراعي بنسبة 0.6٪ في الماء المقطر. تخلط مع شريط التحريك والأوتوكلاف لإحضارها إلى محلول أو تراكب كربوكسي ميثيل سلولوز.

تحضير محلول كربوكسي ميثيل سلولوز 2٪ في الماء المقطر واخلطه من الأوتوكلاف كما كان قبل اليوم التالي للطلاء. استخدم مجهرا مقلوبا للتحقق من طلاقة الخلايا وقابليتها للحياة قبل بدء الفحص. تأكد من أن الخلايا تظهر مورفولوجيا خلوية قياسية وطلاقة مشتركة بنسبة 90٪ تقريبا.

قم بإجراء تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف للعينات المعدية في وسط النمو الخلوي ، مع تغيير عدد التخفيف المطلوب بناء على العيار المتوقع للفيروس المعني. أيضا ، قم بإعداد عينة تحكم غير مصابة لضمان بقاء الخلية بشكل مستقل والمساعدة في تحديد البلاك. ماصة السيطرة غير المصابة والتخفيف التسلسلي في آبار اللوحة ، مع الحرص على تجنب تعطيل الطبقة الأحادية.

استخدم كمية كافية من اللقاح لتغطية الخلايا مع الحفاظ على الحجم منخفضا قدر الإمكان لزيادة الاتصال الفيروسي بالطبقة الأحادية. ضع الصفائح في حاضنة زراعة الأنسجة وقم بإصابة الخلايا لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة كل 20 دقيقة. قم بهز الألواح برفق لضمان تغطية متساوية ولمنع الطبقة الأحادية الخلوية من الجفاف أثناء العدوى.

قم بإعداد حل عمل التراكب للتراكبات السائلة. امزج وسائط البلاك الدافئة و 1.2 إلى 2.4٪ بدرجة حرارة الغرفة قم بتخزين خلية AVY بنسبة واحد إلى واحد للحصول على حل عمل من 0.6 إلى 1.2٪ وسط تراكب خلية avy أو تراكبات AROS أو CMC وسائط البلاك الدافئة المختلطة ، ومحلول مخزون إما ساخن 0.6٪ AROS أو 2٪ CMC بنسبة واحد إلى واحد. ثم ضعه في حمام مائي 56 درجة مئوية ، لمدة 30 دقيقة لموازنة درجة الحرارة.

تأكد من أن المحلول دافئ ولكن ليس ساخنا عند اللمس لمنع موت الخلايا وتقليل العيارات الفيروسية. بعد الإصابة ، ضع التراكبات على الطبقات الأحادية المصابة بعد إضافة ألواح الحضانة المتراكبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى 14 يوما اعتمادا على الفيروس الذي يتم تحليله لإصلاح الخلايا بتراكب سائل ، أو صب أو شفط تراكب الخلية الإلكترونية ، ثم ماصة محلول الفورمالديهايد 10٪ في الآبار وثبتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لطوال الليل أو aros أو CMC مباشرة. أضف محلول الفورمالديهايد إلى التراكب لمدة ساعة إلى ليلة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد التثبيت ، وتخلص من الفورمالديهايد ثم قم بإزالة المقابس شبه الصلبة يدويا حيث تساقط الملعقة.

اشطف لويحات الخلايا العليا بالماء لإزالة مثبت التراكب المتبقي قبل تلطيخها. لتلطيخ ، قم بتغطية الخلايا بأقل قدر ممكن من محلول البنفسجي البلوري لمدة 15 دقيقة تقريبا. هز الألواح إذا لزم الأمر لضمان تغطية متساوية.

اغسل بقعة البنفسج الكريستالية برفق بالماء بمجرد تثبيتها وتلطيخها وتجفيفها إلى أجل غير مسمى لتحليلها في المستقبل. عد اللوحات في كل بئر مع خصم الآبار التي تحتوي على أقل من خمسة أو أكثر من 100 لويحات. خذ متوسط أي تكرارات تقنية لنفس التخفيف.

لاحظ حجم البلاك ومورفولوجيا. حدد العيار الفيروسي لعينة المخزون عن طريق أخذ متوسط عدد اللويحات للتخفيف وعكس عامل التخفيف الكلي. تظهر هذه الصورة مقارنات تراكب بلاك فيروس حمى الوادي المتصدع باستخدام 12 لوحة بئر ، تم طلاء مكاتب مكتبها بمعدل 2.5 في 10 من الخلايا الخامسة في 12 لوحة بئر وأصيبت ب 200 ميكرولتر باستخدام نفس عينة البداية المخففة بشكل متسلسل من MP 12.

بعد الإصابة ، تم تطبيق تراكبات 1.5 مليلتر من 0.3٪ aros 0.6٪ AVY ، أو 1٪ CMC لمقارنة التراكبات مباشرة. يوضح هذا الرسم البياني نتائج عدد البلاك والترتيبات لجميع التراكبات الثلاثة. هنا. تظهر مقارنات تراكب البلاك ViiV باستخدام 12 لوحة بئر ، تم طلاء المكاتب كما كان من قبل وأصيبت بحجم 200 ميكرولتر باستخدام نفس عينة البداية المخففة بشكل متسلسل من سلالة لقاح ViiV TC 83 بعد الإصابة ، تم تطبيق تراكبات 1.5 مليلتر من 0.3٪ aros 0.6٪ خلية أو 1٪ CMC كما كان من قبل.

مرة أخرى ، يوضح الرسم البياني نتائج عدد البلاك والمعايرة لجميع التراكبات الثلاثة. تعرض هذه الصورة مثالا على تراكبات البلاك عالية الإنتاجية. أصيبت صفيحة بئر 96 من VIRs مطلية بثلاثة أضعاف 10 من الخلايا الرابعة لكل بئر ب 50 ميكرولترا من اللقاح باستخدام نفس العينة الأولية المخففة بشكل متسلسل من فيروس حمى الوادي المتصدع MP 12 لمدة ساعة واحدة في مكررة رباعية للتراكبات 0.6 و 1.2٪ تمت تجربة التركيزات النهائية للخلية السريعة من أجل تحديد جدوى وقابلية التكرار لاستخدام التراكبات السائلة بطريقة إنتاجية عالية.

يوضح هذا الرسم البياني العيارات المحددة من كل تراكب. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كل فيروس مختلف وقد يكون من الضروري إجراء تحسينات بما في ذلك استخدام أنواع مختلفة من الخلايا وأوقات الحضانة و / أو وسط النمو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار البلاك الأساسي باستخدام كل من التراكبات السائلة وشبه الصلبة.