التثقيب الكهربائي في الرحم للفئران

يُعد التثقيب الكهربائي In utero تقنية محورية لدراسة الآليات الجزيئية التي توجه التطور العصبي. فمن خلال حقن الحمض النووي DNA لتغيير التعبير الجيني في مناطق محددة من دماغ القوارض النامي، يمكن للباحثين دراسة تكاثر الخلايا العصبية وتمايزها وهجرتها ونضجها في سياق بيئتها الطبيعية.

سيقدم هذا الفيديو المبادئ الأساسية التي يقوم عليها التثقيب الكهربائي in utero، ونظرة عامة أساسية حول كيفية تنفيذ هذه التقنية، وتطبيقاتها في أبحاث البيولوجيا العصبية.

قبل أن نتعمق في كيفية تنفيذ هذا الإجراء، دعونا نستعرض أولاً بعض مبادئ التثقيب الكهربائي (Electroporation). يستخدم هذا الإجراء نبضات كهربائية تعمل على تكوين ثقوب مؤقتة في أغشية الخلايا، مما يسمح للحمض النووي DNA بالدخول إلى الخلية. وبما أن DNA المشحون سلبياً سيتحرك باتجاه القطب الموجب، فإنه يمكن استهداف مجموعات خلوية مختلفة اعتماداً على تموضع المجال الكهربائي.

على الرغم من أن التثقيب الكهربائي قد استُخدم تقليدياً في الدراسات المخبرية in vitro، إلا أن التقدم العلمي قد وسّع نطاق استخدامه ليشمل الأعضاء السليمة، بما في ذلك تلك الموجودة في أجنة الفئران التي تنمو in utero.

يتميز التثقيب الكهربائي في الرحم (In utero electroporation)، على عكس مزارع الخلايا أو تقنيات ex vivo، بأن الخلايا التي تم نقل الجينات إليها ستظل معرضة لجميع الإشارات الفسيولوجية التي توجه التطور الطبيعي. وهذا أمر بالغ الأهمية خاصة في الدماغ، حيث تتطلب هياكل مثل المحاور العصبية إشارات توجيهية من أنواع خلايا أخرى لكي تتطور بشكل صحيح.

ويتضمن تطور الدماغ على وجه الخصوص سلسلة مبرمجة من أحداث التكاثر والهجرة، مما يعني إمكانية استهداف طبقات نسيجية مختلفة بناءً على توقيت عملية التثقيب الكهربائي.

وأخيراً، تتيح توفر أنواع مختلفة من الأقطاب الكهربائية للباحثين الوصول إلى المناطق القريبة من سطح الدماغ وكذلك المناطق الأكثر عمقاً. تُستخدم الأقطاب المجدافية (Paddle electrodes) عند استهداف الأجزاء السطحية من الدماغ، مثل القشرة والحصين، بينما تُستخدم أقطاب إبرية أصغر عند استهداف الهياكل العميقة مثل المهاد وتحت المهاد.

بعد أن ناقشنا بعض المبادئ الأساسية لهذه التقنية، دعونا ننهي التحضيرات لنتمكن من التعمق في الإجراء الجراحي وعملية التثقيب الكهربائي in utero.

أولاً، قم بتعقيم جميع الأدوات ومسح منطقة الجراحة بـ 70% ethanol. بعد ذلك، قم بتحضير محلول الحقن عن طريق إذابة plasmid DNA في PBS معقم يحتوي على 0.1% Fast Green؛ حيث يُضاف Fast Green للسماح برؤية محلول الحقن داخل الجنين. وأخيراً، يجب استخدام ساحب الإبر لإنشاء إبرة فائقة الدقة لتقليل فقدان السائل السلوي وما يتبع ذلك من نفوق الأجنة.

بعد أن أعددنا كل شيء، دعونا نستعرض الخطوات الأساسية لإجراء التثقيب الكهربائي لأنسجة الدماغ في القوارض النامية. ابدأ بتخدير الأم الحامل باستخدام 5% isoflurane، ثم انقلها إلى أنبوب جهاز التنفس الذي يمدها بـ 2.25% isoflurane طوال فترة الإجراء. بعد ذلك، ولتسكين الآلام بعد الجراحة، يتم حقن مسكن للألم مثل buprenorphine تحت الجلد. ثم قم بحلاقة البطن وتعقيم موقع الشق الجراحي.

لكشف الرحم جراحياً، قم بعمل شق رأسي على طول الخط المتوسط في الجلد، وباستخدام المقص، اقطع من خلال البريتون. ولمنع جفاف الأجنة، غطِّ الفتحة بشاش مبلل بمحلول ملحي معقم. بعد ذلك، اسحب سلسلة الأجنة برفق خارج التجويف البطني مع التأكد من بقاء الأجنة رطبة عن طريق تغطيتها بمحلول ملحي معقم ومسخن مسبقاً.

باستخدام مجهر التشريح، حدد الأجنة ذات الوضعية المناسبة التي تتيح وصولاً سهلاً إلى الدماغ. وباستخدام أصابعك أو الملقط، قم بتثبيت رأس الجنين وحقن محلول DNA عبر جدار الرحم وصولاً إلى الدماغ. ضع قطباً كهربائياً على كل جانب من الرأس، بحيث يكون القطب الموجب في الاتجاه الذي تريد تثقيب الـ DNA كهربائياً نحوه. وبمجرد الانتهاء من التثقيب الكهربائي لجميع الأجنة ذات الوضعية المناسبة، أعد قرن الرحم بعناية إلى التجويف البطني.

قبل إغلاق الشق، أضف 2 - 3 ml من المحلول الملحي الدافئ إلى التجويف. قم بخياطة البريتون معاً باستخدام خيوط جراحية قابلة للامتصاص، ثم أغلق الجلد باستخدام الدباسات الجراحية. وأخيراً، انقل الفأرة إلى قفص يحتوي على وسادة تدفئة وقم بمراقبتها.

بعد أن استعرضنا كيفية إجراء التثقيب الكهربائي in utero، دعونا نتفحص بعض التطبيقات اللاحقة لهذه التقنية.

يُعد التثقيب الكهربائي in utero أداة مفيدة لبحث كيفية مساهمة جينات محددة في التطور العصبي. حيث يمكن للبنى التي يتم إدخالها عن طريق التثقيب الكهربائي أن توجه الإفراط في تعبير البروتينات البرية (wildtype) أو الطافرة، أو تمنع تعبير البروتين تماماً. ومن ثم يمكن تقييم الأنماط الظاهرية العصبية إما على المستوى المجهري أو على مستوى الكائن الحي. فعلى سبيل المثال، حدد هؤلاء الباحثون أن الإفراط المؤقت في تعبير الجين المرتبط بالفصام، DISC-1 في دماغ الفأر النامي، أدى إلى فرط الحساسية للأمفيتامين في مراحل لاحقة من الحياة.

كما يمكن أن يكون التثقيب الكهربائي in utero مفيداً لتصور مجموعات خلوية محددة والروابط التي تشكلها عن طريق إيصال تسلسلات تشفر البروتينات الفلورية إلى الأنسجة العصبية. على سبيل المثال، قام هؤلاء الباحثون بإجراء تثقيب كهربائي لجين البروتين الفلوري الأخضر في شبكيات في المرحلة E13.5 لدراسة خلايا العقد الشبكية، أو RGCs، التي تنقل المعلومات البصرية من العين إلى الدماغ. ويظهر فحص الشبكيات في المرحلة E18.5 كيف يمكن استخدام هذه التقنية لتتبع مسار محور الـ RGC عبر العصب البصري، والتصالب البصري، والسبيل البصري.

أخيراً، تحدث العديد من الأحداث المهمة في التطور العصبي بعد الولادة، مما ألهم العلماء لتطوير تقنية معدلة تسمى التثقيب الكهربائي in vivo. تتبع هذه العملية نفس الخطوات الأساسية للتثقيب الكهربائي in utero، ولكنها تُجرى عادةً خلال الأيام القليلة الأولى بعد الولادة. ويُعد التلاعب الجيني بعد الولادة مفيداً بشكل خاص لدراسة أنواع الخلايا التي تظهر في مراحل متأخرة، مثل تلك الموجودة داخل البصلة الشمية الموضحة هنا.

لقد شاهدتم للتو فيديو JoVE حول التثقيب الكهربائي in utero. تضمن هذا الفيديو المبادئ الأساسية ونظرة عامة أساسية حول كيفية إجراء التثقيب الكهربائي in utero، بالإضافة إلى بعض التطبيقات اللاحقة التي تتيح للباحثين استقصاء الآليات الجزيئية التي توجه التطور العصبي.

شكراً للمشاهدة!