Name: العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: تعلم عزل الخلايا الظهارية السلية البشرية باستخدام مادة التربسين الخالية من المنتجات الحيوانية. تضمن هذه الطريقة الامتثال لمعايير التصنيع الجيدة وتناسب التطبيقات السريرية في الطب التجددي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يقر المؤلفون بالدعم المالي من برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية التابع لحكومة فيكتوريا.

ملاحظة: المشيمة ينبغي جمع من الحمل صحية مفردة، مع تفضيل أقسام المدى القيصرية الاختيارية. مكتوبة، ينبغي إيلاء الموافقة المسبقة لجمع المشيمة عند هؤلاء النساء. ينبغي للجنة أخلاقيات البحث الإنسان الخاص ذات الصلة موافقة جميع عمليات جمع واستخدام الأنسجة البشرية. 1. عزل الخلايا الظهارية السلى <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المشيمة على سطح معقمة داخل خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام هانكس معقمة محلول ملحي متوازن (HBSS)، وغسل الكثير من الدم ممكن من سطح المشيمة والأغشية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع المشيمة وضعت مع الحبل السري تواجه تصل، فصل ميكانيكيا الحافة الخارجية للالسلى والمشيمه الأغشية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة فصل، تجريد يدويا غشاء السلى من غشاء المشيمه من المشيمة، والعمل حول حافة الغشاء، نحو الحبل السري. ملاحظة: كن carefالمجاهدين لإزالة أي قطعة من تلوث غشاء المشيمه من السلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص العقيمة، وقطع غشاء السلى يقرب من 2 سم من قاعدة الحبل السري ومكان في 500 مل مختومة حاوية تحتوي على 250 مل HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا عن طريق هز زجاجة مغلقة تحتوي على غشاء السلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غشاء السلى من حاويات خاصة لجمع باستخدام ملقط معقم، والمكان إلى 15 سم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع غشاء السلى إلى قطع ما يقرب من 5 سم طويلة (عندما عقدت رأسيا مع ملقط)، ونبذ قطع الدموية أو تمزقها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في 500 مل مختومة الحاويات ويغسل مع 250 مل HBSS حوالي 3-5 مرات أو حتى يصبح غشاء السلى شفافة مع عدم وجود الدم الملوثة. ملاحظة: أي الحاضر الدم قد يقلل من كفاءة الهضم الأنزيمي الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل قطعة من غشاء السلى في وعاء يحتوي على 50 مل من الأنزيمية الهضم حل، مع الحرص علىتقليل المرحل من HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان القطع السلى في الأنزيمية الهضم حل في حمام مائي أو غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف لإزالة أي الدم المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قطع غشاء السلى من الأنزيمية الهضم حل وضعها في وعاء معقم جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من الأنزيمية جديدة هضم حل للغشاء السلى واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حمام مائي أو غرفة دافئة مع طيف والهز (الهضم الأول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السلى قطع الغشاء ووضع في جديدة الرعاية أخذ حاوية للسماح للهضم الأنزيمية حل لاستنزاف من كل قطعة من الغشاء. ملاحظة: ويمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب القطع السلى على طول الحافة الداخلية للحاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من الأنزيمية جديدة هضم حل للالسلى قطع الغشاء واحتضان 60 دقيقة في حمام مائي أو غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف (الهضم الثاني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير suspensi خليةعلى من الخطوة 1.14 من خلال مرشح 70 ميكرون والطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتجاهل طاف، و resuspend بيليه خلية في 4 مل HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع ماصة 1 مل للحصول على تعليق خلية واحدة. ملاحظة: في هذه المرحلة الخلايا يمكن أن تترك على الجليد حتى الخلايا من هضم الثاني هي في نفس المرحلة من المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السلى قطع الغشاء ووضع في جديدة الرعاية أخذ حاوية للسماح للهضم الأنزيمية حل لاستنزاف من كل قطعة من الغشاء. ملاحظة: ويمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب القطع السلى على طول الحافة الداخلية للحاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير تعليق الخلية من الخطوة 1.18 من خلال مرشح 70 ميكرون والطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتجاهل طاف، و resuspend بيليه خلية في 4 مل HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع 1 مل صipette للحصول على تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا تجمع من اثنين من هضم أو بدلا من ذلك الحفاظ على هضم خلية فصل حتى بعد عدد الخلايا. ملاحظة: هذا يمنع الاختلاط الخلايا الجدوى يحتمل أن تكون منخفضة مع الخلايا قابلية عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة HBSS إلى الحجم النهائي من 10-20 مل وتنفيذ عدد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق لقياس قدرتها على البقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد النمط الظاهري الخلايا الظهارية بواسطة التدفق الخلوي. تشكل الكوكتيلات الأجسام المضادة المناسبة استخدام الألغام المضادة للEpCAM-PE (1: 2 التخفيف) لمكافحة CD90-PeCy5 (1: 250) ومكافحة CD105-APC (1: 100) في HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend مجموعة فرعية من الخلايا من واحد أو كلا هضم في كوكتيل الأجسام المضادة بتركيز 25 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالتدفق الخلوي، وصمة عار 1 × 10 6 خلايا مع الكوكتيلات الأجسام المضادة التي تحتوي على الضوابط نمط إسوي (على سبيل المثال. ضبط PE مفتش 1 + نمط إسوي مكافحة CD90-PeCy5 + مكافحة CD105-APC). إبقاء ~ 1 × 10 6 خلايا غير ملوثين لتدفق عداد الكريات انشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في الجسم المضادالكوكتيلات في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3X في HBSS و resuspend كل 5 إلى 10 مليون خلية لكل مليلتر عن التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التدفق الخلوي والنتائج المذكرة. ومن المتوقع أن يكون 90-95٪ و&lt;1٪ على التوالي نقاء عزل الخلية (نسبة EpCAM إيجابي وCD90 / CD105 خلايا السلبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخصيص عدد مناسب من الخلايا لاختبار المعايير المناسبة لمراقبة الجودة أو الإفراج على النحو الذي يحدده التطبيق النهائي. ملاحظة: يمكن أن يتضمن هذا المرض / الفحص الفيروسي، أو السلامة الأخرى أو المعايير البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على الخلايا المتبقية، متابعة بروتوكول الحفظ بالتبريد، أو بدلا من وضع مباشرة في ثقافة (المباشرة للثقافة الخطوة 3.6). </li></ol> 2. الحفظ بالتبريد من hAECs <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام التدفق الخلوي البيانات أو العد والفرز اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلية في resuspendالصورة بين 1-10٬000٬000 خلايا لكل مل في الحيوانات خالية من المنتج الإعلامي الحفظ بالتبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة حجم مناسب من الخلايا في قارورة الحفظ بالتبريد-الحلقية O والمكان الى جهاز معدل تجميد تسيطر عليها حيث يحدث التبريد في حوالي 1 ° C / دقيقة حتى -80 درجة يتحقق C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قوارير في النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. </li></ol> 3. ذوبان وثقافة Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قارورة الحفظ بالتبريد من النيتروجين السائل ووضع على الجليد. ملاحظة: بالنسبة للنقل فقط - المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قارورة الحفظ بالتبريد بسرعة عند 37 درجة مئوية حتى فقط قطعة صغيرة (~ 5 مم × 5 مم) من يبقى الجليد. ملاحظة: من المهم أن الحل الخلية لا الحارة للحد من الآثار السامة للDMSO في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد 10 أضعاف مع الباردة (~ 4 ° C) خالية من المصل وسائل الإعلام، وأضاف الإفلات من الحكمة في حجم مناسبد أنبوب أو حاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في المصل خالية المتوسطة، إلى تركيز تقريبي من 1 مليون خلية لكل مليلتر. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام الفرز الآلي أو اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق. ويتوقع بقاء بعد ذوبان الجليد يكون 5-10٪ أقل من الجدوى قبل الحفظ بالتبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا على القياسية خلية المعالجة الثقافة البلاستيك وير، أو بدلا من ذلك استخدام النوع الأول الكولاجين على الأسطح الثقافة معطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمن النوع الأول الكولاجين طلاء اتباع البروتوكول التالي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حامض للذوبان النوع الأول الكولاجين من المشيمة البشرية (15 ملغ الكولاجين مع 25 مل من الماء منزوع الأيونات و 50 ميكرولتر حمض الخليك الجليدي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الكأس مع بارافيلم ويقلب باعتدال عند 37 درجة مئوية حتى تذوب خيوط الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معقم حل مرشح الكولاجين باستخدام فلتر 0.22 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تصفيتها الكولاجين 1:10 الأسهم مع الماء منزوع الأيونات. هذا المخزون المخفف هو العمل بغية دراسته واقرارهحل ntration للأسطح طلاء من البلاستيك والغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكولاجين البلاستيك معطف، والزجاج، وغشاء الأسطح لمدة 2 ساعة على RT عند 37 درجة مئوية، أو O / N في 2-8 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السوائل الزائدة من السطح المطلي، واتركه حتى يجف O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع زراعة الأنسجة المياه الصف معقمة أو HBSS قبل إدخال الخلايا والمتوسطة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hAECs لوحة في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلية / سم 2 في المصل خالية المتوسطة، والسماح التعلق تحدث عن 72-96 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد التعلق، وتغيير وسائل الإعلام بواسطة الشفط بعناية واستبدالها مع حجم مناسب من المصل خالية المتوسطة كل 2-3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا مرور باستخدام بروتوكول أدناه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام ثقافة الخلية وتغسل مع حجم 1X من معقم HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم 1X من الأنزيمية الهضم الحل واحتضان لمدة 5-15 دقيقة، أو حتى خلايا لوحظ فصل من سطح ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأنزيمية الهضم محلول يحتوي على الخلايا، وضمان مLLS يتم فصل من سطح ثقافة الخلية بواسطة pipetting مرارا الأنزيمية الهضم حل ضد سطح خلية ثقافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه الخلية في حجم مناسب من HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع ماصة 1ML للحصول على تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المصل خالية المتوسطة إلى تركيز تقريبي من 1 مليون خلية / مل. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام الفرز الآلي أو اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hAECs لوحة في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلية / سم 2 في المصل خالية المتوسطة، والاستمرار في طرق زراعة القياسية. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+SV+%22Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine%22">Stem Cells and Regenerative Medicine</a>. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+and+placental+membranes%3A+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Reprod.+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta%3A+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li>
<li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li>
<li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).</li>
<li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li>
<li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li>
<li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li>
<li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li>
<li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li>
<li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li>
<li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biocell%22%5BJournal%5D)">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li>
<li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631(2012).</li>
<li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533(2012).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li>
<li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763(2012).</li>
<li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li>
<li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li>
<li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li>
<li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+A+%22Newborn+Stem+Cells%3A+Identity%2C+Function%2C+and+Clinical+Potential%22">Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

هناك العديد من المعلمات الحرجة التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير في نجاح هذه المنهجية. تخزين المشيمة أو السلى لمدة تصل إلى 3 ساعات قبل عزل hAECs قد يكون من المرغوب فيه لأغراض لوجستية أو جدولة، ومع ذلك فمن المستحسن أن تتم معالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن. إذا الأنسجة ليتم تخزينها، فمن المستحسن أن تخزين أن يؤديها التالية تشريح وغسل غشاء السلى. السلى يمكن تخزينها في HBSS العقيمة التي تحتوي على المضادات الحيوية في 4 درجات مئوية، ومع ذلك بقاء الخلية يمكن أن تقلل مع تمديد فترة التخزين. ون...

وقد اجتذبت الخلايا المشتقة من مصادر فترة ما حول الولادة، مثل المشيمة والأغشية المشيمية، الحبل السري والسائل الذي يحيط بالجنين الاهتمام من الباحثين والأطباء كمصدر محتمل للخلايا الطب التجديدي 1،2. والسبب في هذا الاهتمام هو أن هذه الأنواع من الخلايا كل تمتلك قدرا من المرونة والقدرة المناعية 3، الخصائص التي تعتبر أساسية لتطبيقات العلاجية المحتملة. hAECs هي السكان الظهارية غير المتجانسة التي يمكن استخلاصها من مصطلح أو قبل الأجل السلى غشاء 4، وتوفير مصدر محتمل وفيرة من المواد الخلوية التجدد. الخصائص التي تجعل hAECs جذابة كعلاج الخلوي تتضمن multipotency بهم، وانخفاض المناعية، وخصائص مضادة للالتهابات. تم العثور على hAECs أن يكون متعدد القدرات العالية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية، وقادرة على التفريق في الأنساب أرومية متوسطة (cardiomyocytes، myocytes، osteocytes، الخلايا الشحمية)، الأنساب الأديم الباطن (خلايا البنكرياس وخلايا الكبد وخلايا الرئة) والأنساب الأدمة (الشعر، والجلد، والخلايا العصبية والخلايا النجمية) 5-10. مطمئن، على الرغم من hAECs multipotency بهم لا تظهر إلى أي شكل أو أورام تعزيز التنمية الورم في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، hAECs هي أيضا في مأمن حظا، معربا عن انخفاض مستويات مستضدات الكريات البيض الدرجة الثانية البشرية (HLAs) 8. هذا العقار على الأرجح راء قدرتهم على التهرب من الرفض المناعي بعد زرع خيفي وxenogenic، كما هو موضح في الدراسات التي تستخدم القرود المناعة المختصة والأرانب وخنازير غينيا والجرذان والخنازير 11-13. عرض hAECs المناعية قوية وخصائص المثبطة للمناعة وبالتالي توفر مزايا عملية كبيرة لالتطبيقات السريرية المحتملة في علاج أمراض المناعة الذاتية. ويعتقد hAECs لممارسة مهام المناعية على كل من أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. في(ه) من الآليات المقترحة، هو من خلال إفراز المناعية عوامل 14. وتشمل التطبيقات الحالية للhAECs في نماذج الأمراض الحيوانية ما قبل السريرية لعلاج السكتة الدماغية، والتصلب المتعدد، وأمراض الكبد والسكري وأمراض الرئة المزمنة والحادة. وقد أظهرت الباحثون اهتماما باستخدام hAECs لعلاج ما بعد السكتة الدماغية والتهاب الدماغ بسبب خصائصها الفريدة. هناك أدلة على أن hAECs يمكن عبور حاجز الدم في الدماغ حيث يمكنهم تدبر، البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 60 يوما، وتفرق في الخلايا العصبية، وتقليل الالتهاب وتعزيز تجديد الأنسجة التالفة الجهاز العصبي المركزي في النماذج الحيوانية من الأمراض العصبية 15. hAECs توفر القدرة على استهداف وعكس مسارات متعددة المرضية التي تساهم في تطور وتقدم مرض التصلب المتعدد. على سبيل المثال، ينتج من الدراسات على الحيوانات ما قبل السريرية تشير إلى أن hAECs هي مناعة بقوة ويمكن أن يحتمل لحث على التسامح المناعي الطرفية وعكس الاستجابات الالتهابية الجارية. كما تبين hAECs لديها القدرة على التمايز إلى خلايا العصبية في الجسم الحي وتعزيز neuroregeneration الذاتية من خلال إفراز مجموعة واسعة من التغذية العصبية عوامل 16. وقد أظهرت الخلايا الظهارية الإنسان والقوارض السلى بالفعل فعاليتها العلاجية لعلاج أمراض الكبد في النماذج الحيوانية. في رابع كلوريد الكربون نموذج الضرر تحريض أمراض الكبد، وhAEC زرع تؤدي إلى engraftment من hAECs قابلة للحياة في الكبد، وترافق مع انخفاض الخلايا الكبدية، وانخفاض التهاب الكبدي وتليف 17. hAECs يمكن حفز لعوامل البنكرياس أعرب بما في ذلك الأنسولين والجلوكوز النقل. حققت العديد من الدراسات إمكانية hAECs لاستعادة مستويات السكر في الدم في الفئران السكري 18. في الفئران تلقيhAECs، انخفضت كل من الوزن والسكر في الدم جسم الحيوان المستويات لمستوياتها الطبيعية بعد حقن الخلايا. هذه الدراسات تمثل حجة قوية لاستخدام hAECs لعلاج داء السكري. hAECs يكون لها دور ثبت في منع وإصلاح التجريبية الحادة والمزمنة إصابة الرئة في كل من الكبار ونماذج حديثي الولادة 19. وجدت هذه الدراسات أن hAECs التفريق في المختبر في الرئة وظيفية الخلايا الظهارية معربا متعددة البروتينات المرتبطة الرئة، بما في ذلك التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، والقناة الايونية التي تحور في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي 20. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم تسليم hAECs إلى الكبار المصابين والرئة لحديثي الولادة، وأنها تمارس تأثيراتها تعويضية عن طريق تعديل الخلايا المناعية، والحد من التوظيف الكرية البيضاء الرئوي، بما في ذلك العدلات، الضامة والخلايا اللمفية 21-23. ونظرا فرة بهم،سجل السلامة، والتطبيقات السريرية مؤكدة لأمراض متعددة، والتجارب السريرية باستخدام hAECs أمر لا مفر منه. وذلك بهدف الإسراع في ترجمة العلاجات hAEC في التجارب السريرية، قمنا بتطوير طرق لعزل وcryopreserve وhAECs الثقافة بطريقة مناسبة للتجارب السريرية، وذلك باستخدام الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية وفقا للممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب) المبادئ التوجيهية . نحن مقرها هذا البروتوكول بروتوكول نشرت سابقا التي كنا نستخدمها بنجاح لعزل hAECs باستخدام الكواشف المشتقة من الحيوانات 6. نحن تغيير البروتوكول الأصلي ليحل محل المنتجات المشتقة من الحيوانات مع الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية، وأجريت الأمثل لاحق لتحسين العائد الخلية، وسلامة ونقاء. كان هدفنا لوضع بروتوكول من شأنه أن تمتثل للمعايير التنظيمية لتصنيع الخلايا للتجارب السريرية الإنسان.

<table><tbody><tr><td>مجموعة</td><td></td><td></td><td></td></tr> مجموعة صينية <tr><td>تجريد</td><td>فيشر Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Dressing Corpp ، مدبب 13 سم</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>مقص - حاد / حاد مستقيم</td><td>فيشر Scientific</td><td>NC0562592&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>قفازات مطاطية معقمة&nbsp;</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr> ملابس <tr><td>واقية</td><td></td><td></td><td></td></tr> من <tr><td>الملابس الواقية (ثوب)</td><td>عباءات عزل U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>قفازات</td> مطاطية معقمة U-line <td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>؛</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>قناع الوجه للأغراض العامة</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>حذاء Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>يغطي</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media والكواشف</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks ' محلول الملح المتوازن (HBSS)</td><td>14175095 Life Technologies</td><td></td><td>بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم</td></tr><tr><td>TrypZean (منتج حيواني&ndash; التربسين المؤتلف الحر)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>مثبط التربسين فول الصويا&nbsp; 1 جم / 50 مل</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>كاشف تريبان الأزرق</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype التحكم</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>التحكم في النمط المتنظير PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>التحكم في النمط المتنظير</td><td>APC BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>الكولاجين النوع السادس</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>مستهلكات</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 مل ماصة متدرجة</td><td>BD / Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 مل ماصة متدرجة</td><td>BD / Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 مل ماصة متدرجة</td><td>BD / Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنابيب الصقر BD</td><td>/ Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنابيب الصقر BD</td><td>/ Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>أطباق بتري 15 سم</td><td>كورنينج</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 مو ؛ مرشحات م</td><td>BD / Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & مرشحات M</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 مل أطراف ماصة</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu ؛ ل نصائح الماصة</td><td>فيشربراند</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 مل حقنة</td><td>BD / ملعقة بلاستيكية</td><td>طبية 309661</td><td></td></tr><tr><td></td><td>فيشر Scientific</td><td>14-245-97 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>قارب وزن بلاستيكي</td><td>فيشر ساينتيك</td><td>02-202-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>قوارير التبريد</td><td>Nunc</td><td>معدات</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 377267 <tr><td>السيد فروستي</td><td>فيشر العلمية</td><td>A451-4 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>خزانة</td><td></td><td></td><td></td> Biohazard</tr></tbody></table>

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

جذبت الخلايا الظهارية للسلى البشري (hAECs) المشتقة من أغشية السلى الناضجة أو المبكرة انتباه الباحثين والأطباء كمصدر محتمل للخلايا للطب التجديدي. سبب هذا الاهتمام هو دليل على أن هذه الخلايا لديها قدرة تمايز متعددة القدرات ، ومناعة منخفضة ، ووظائف مضادة للالتهابات. دفعت هذه الخصائص الباحثين إلى التحقيق في إمكانات hAECs لاستخدامها لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض والاضطرابات في الدراسات التي أجريت على قبل السريرية بنجاح كبير.
وجدت hAECs تطبيقا واسع النطاق لعلاج مجموعة من الأمراض والاضطرابات. تشمل التطبيقات السريرية المحتملة ل hAECs علاج السكتة الدماغية والتصلب المتعدد وأمراض الكبد والسكري وأمراض الرئة المزمنة والحادة. يتطلب التقدم من الدراسات التي أجريت على قبل السريرية إلى التجارب السريرية مستوى أعلى من مراقبة الجودة والسلامة لمنتجات العلاج الخلوي. لاعتبارات السلامة ومراقبة الجودة ، يفضل أن تستخدم بروتوكولات عزل الخلايا كواشف خالية من المنتجات الحيوانية. 
لقد طورنا بروتوكولات للسماح للباحثين بعزل hAECs وحفظها بالتبريد واستزراعها باستخدام كواشف خالية من المنتجات الحيوانية. تتمثل ميزة هذه الطريقة في أنه يمكن عزل هذه الخلايا وتوصيفها وحفظها بالتبريد وزراعتها دون التعرض لخطر توصيل مسببات الأمراض الحيوانية الضارة المحتملة إلى البشر ، مع الحفاظ على غلة الخلايا المناسبة وقابلية البقاء وإمكانات النمو. بالنسبة للباحثين الذين ينتقلون من الدراسات التي أجريت على قبل السريرية إلى التجارب السريرية ، فإن هذه المنهجيات ستسرع بشكل كبير من الموافقة التنظيمية وتقلل من المخاطر وتحسن جودة مجموعات الخلايا العلاجية.

عندما يتبع هذا الإجراء بشكل صحيح، ينبغي أن يتوقع متوسط ​​العائد من 120 مليون hAECs، مع مجموعة نموذجية من 80-160٬000٬000 الخلايا. من هذه المحاصيل، ويمكن توقع متوسط ​​بقاء 83 ± 4٪. قد يكون زيادة متوسط ​​العائد وانخفاض طفيف جدوى في طريقة السريري بسبب ارتفاع النشاط التربسين من المنتج المشتق من الحيوان، وربما أيضا بسبب عدم وجود بروتينات مصل. hAECs معزولة إن متوسط ​​الشخصي سطح الخلية من 92٪ EpCAM خلايا إيجابية مع &lt;1٪ CD90، CD105 علامة الوسيطة خلايا إيجابية. وقد تم اختيار هذه العلامات...

نصف بروتوكولا لعزل واستزراع الخلايا الظهارية للسلى البشري (hAECs) باستخدام الكواشف الخالية من المنتجات الحيوانية وفقا لإرشادات ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP).

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجموعة الخلايا الظهارية من غشاء السلى البشري. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجريد غشاء السلى أولا من غشاء الكوريون والمشيمة في الخطوة الثانية. يتم غسل غشاء السلى من جميع آثار الدم ثم يتم هضمه بمحلول إنزيم التربسين الخالي من المنتجات الحيوانية.في الخطوة الأخيرة ، يتم ترشيح ملاط الأنسجة لجمع الخلايا الظهارية المعزولة. في النهاية ، يمكن تقييم نقاء مجموعة الخلايا الظهارية في السلى عن طريق تحليل التدفق الخلوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها لا تتطلب تعرض الخلايا للمنتجات الحيوانية الحيوانية ، مما يعني أن هذه الخلايا مفيدة للتجارب السريرية.لعزل الخلايا الظهارية السلى ، ابدأ بوضع المشيمة على سطح معقم داخل خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. ثم استخدم HBSS المعقم لغسل أكبر قدر ممكن من الدم من سطح المشيمة. بعد ذلك، ضع المشيمة بحيث يكون الحبل السري وأغشية المشيمة متجهة لأعلى وقم بتجريد غشاء السلى يدويا من غشاء كوريون المشيمة الذي يعمل حول حافة الغشاء باتجاه الحبل السري.احرص على إزالة أي قطع من غشاء القنبلة الملوث من السلى ، ثم استخدم مقصا معقما لقطع غشاء السلى على بعد سنتيمترين تقريبا من قاعدة الحبل السري ووضع الغشاء في وعاء سعة 500 مل يحتوي على 250 مل من HBSS ، وأغلق الحاوية ورجها جيدا لغسل الأنسجة ، ثم استخدم ملقطا معقما لنقل الغشاء إلى طبق بتري 15 سم. الآن ، قم بتقطيع الغشاء إلى قطع رأسية بطول خمسة سنتيمترات واغسل القطع ثلاث إلى خمس مرات أخرى كما هو موضح للتو حتى يصبح الغشاء شفافا بدون دم ملوث. عند إزالة كل الدم ، انقل قطع الأنسجة إلى 50 مل من محلول Enzymatic Digest ، مع أخذ kers لتقليل ترحيل أي HBSS واحتضان أنسجة السلى في غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف لإزالة أي من الدم المتبقي بعد 15 دقيقة ، اسحب كل قطعة على طول الحافة الداخلية للحاوية لتصريف محلول الهضم القديم وإضافة القطع إلى 100 مل من محلول الهضم الأنزيمي الطازج.بعد ساعة من الهضم في نفس الظروف ، انقل الأغشية إلى وعاء جديد من محلول Enzymatic Digest. الحرص على تصريف الأنسجة كما هو موضح للتو وتحريك الأغشية برفق لمدة 60 دقيقة أخيرة بعد الهضم الثاني. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مرشح 70 ميكرومتر ، ثم قم بتدوير ملاط الخلية لمدة 10 دقائق عند 1000 جي ودرجة حرارة الغرفة ، أعد تعليق الحبيبات برفق في أربعة ملليلتر من مثبط الإنزيم القائم على فول الصويا لإنشاء معلق خلية واحدة ، ثم أضف HBSS إلى الخلايا إلى حجم نهائي من 10 إلى 20 ملليلترا.حدد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد الأزرق ، ثم الحفاظ على الخلايا الظهارية السلى المعزولة. أولا ، قم بثنيها لمدة خمس دقائق عند 700 جبن ودرجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الحبيبات مرة واحدة 10 من ستة إلى واحد في 10 من الخلايا السابعة لكل مليلتر في وسائط حفظ التبريد الخالية من المنتجات الحيوانية والماصة حجما مناسبا من الخلايا في قوارير حفظ بالتبريد الحلقية.أخيرا ، ضع القوارير في جهاز تجميد معدل متحكم فيه حيث يحدث التبريد عند درجة مئوية واحدة تقريبا في الدقيقة حتى يتم تحقيق 80 درجة مئوية تحت الصفر ، ثم قم بنقل القوارير إلى نيتروجين سائل للتخزين طويل الأجل. تعمل العديد من الوسائط الخالية من المنتجات الحيوانية بشكل مناسب. ومع ذلك ، فإن تركيز DMSO الأمثل هو ما يقرب من خمسة إلى 10٪ عادة ما تكون الجدوى المتوقعة بعد الذوبان أقل بخمسة إلى 10٪ من قابلية البقاء قبل الحفظ بالتبريد ويمكن أن تكون أكبر بكثير للمستخدم عديم الخبرة.يمكن إجراء زراعة الخلايا باستخدام الخلايا الظهارية للسلى البشري لتمكين توصيف الخلايا أو تمايزها لمزيد من التحليل النهائي لأنها تحافظ على نمطها الظاهري الظهاري في وسط الثقافة الخالية من المصل. بالإضافة إلى امتلاك خصائص منظمة للمناعة ومضادة للالتهابات ، فقد ثبت أن الخلايا الظهارية للسلى البشرية متعددة المستويات ، في المختبر وفي الجسم الحي ، وتتمايز إلى سلالات خلوية تمثل الطبقات الجرثومية الأولية الثلاث بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لإجراء تجارب سريرية لحالات مثل أمراض الرئة والكسب غير المشروع مقابل مرض المضيف.

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

منذ جيمس طومسون وآخرون تطوير تقنية في عام 1998 لعزل وتنمو HES في الثقافة ، وتصبح خلايا لاستخدامها لاحقا تجميد والذوبان ، وتوسيع الخلايا من الأوراق المالية المجمدة الاجراءات الهامة التي أجريت في خلية ثقافة HES الروتينية. منذ HES خلايا حساسة للغاية لتؤكد للتجميد والذوبان ، يجب توخي الحذر خاصة. نحن هنا لشرح الطريقة المناسبة لإذابة الخلايا بسرعة HES من المخزونات النيتروجين السائل ، والطلاء لهم على الخلايا الجنينية الماوس المغذية ، وتجميد ببطء لهم على المدى الطويل التخزين.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

ويصف هذا البروتوكول إعادة برمجة الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent استخدام نهج ابيسومال غير دمج في ظروف محددة بالكامل كيميائيا. وترد تفاصيل إجراءات استخراج والثقافة، وإعادة برمجة، وتوصيف الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent الناتجة بطرق صارمة.

إعادة برمجة الابتدائي السائل السلوى وغشاء الخلايا بلوريبوتينسي في ظروف خالية من كرة

تقدم هذه الدراسة إجراء التحقق من صحة والأمثل للعزلة والثقافة البشرية الخلايا اللحمية الرحم لإجراء الفحص في المختبر ديسيدواليزيشن. علاوة على ذلك، توفر هذه الدراسة طريقة مفصلة لضربة قاضية كفاءة جين معين باستخدام سيرناس في الخلايا اللحمية الرحم البشرية.

عزل الخلايا اللحمية الرحم البشرية في المختبر ديسيدواليزيشن

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الظهاريه من المناطق التشريحية المختلفة من الغشاء السلوى البشري لتحديد تغايرها وخصائصها الوظيفية للتطبيق المحتمل في النماذج السريرية والفسيولوجية.

في المختبر الثقافة من الخلايا الظهاريه من المناطق التشريحية المختلفة من الغشاء السلوى الإنسان

هنا ، نحن وصف طريقة للاحترار البلاستوسيستات البشرية vitrified ، وزراعة لهم من خلال فترة زرع في المختبر ، وهضمها في خلايا واحدة وجمع الخلايا الأرومية في وقت مبكر لمزيد من التحقيق.

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

تشير هذه الدراسة إلى بروتوكول لفحص الكروموسومات للأجنة البشرية يستخدم وسط مزرعة مستهلك ، والذي يتجنب خزعة الجنين ويتيح تحديد الصيغة الصبغية للكروموسوم باستخدام NGS. تقدم هذه المقالة الإجراء التفصيلي ، بما في ذلك إعداد وسط الثقافة ، وتضخيم الجينوم الكامل (WGA) ، وإعداد مكتبة تسلسل الجيل التالي (NGS) ، وتحليل البيانات.

فحص الكروموسومات للأجنة البشرية قبل الزرع باستخدام وسط الثقافة المستهلكة: جمع العينات وتحليل الصيغة الصبغية الكروموسومية

هنا نصف عزل وتضخيم وتمايز الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE) في واجهة الهواء السائل وبروتوكول البنوك الحيوية الذي يسمح بتجميد ومن ثم إذابة HNE المضخمة بنجاح. يحلل البروتوكول الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE المتباينة وتصحيح إفراز الكلوريد المرتبط ب CFTR على علاجات معدلة مختلفة.

الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية: البنوك الحيوية في سياق الطب الدقيق

توفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا للحفظ بالتبريد الفعال للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية.

الحفظ بالتبريد للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المرحلة المثلى

تشير الدراسة الحالية إلى بروتوكول أسهل وموفر للوقت واقتصادي لعزل وتنمية الخلايا الظهارية الثديية البشرية الأولية (HMECs) بكفاءة من كميات صغيرة من الأنسجة الثديية. هذا البروتوكول مناسب لإنتاج HMECs الأولية بسرعة لكل من التطبيقات المختبرية والسريرية.

عزل وثقافة الخلايا الظهارية الثديية البشرية الأولية

يصف هذا البروتوكول نموذجا جديدا ثلاثي الأبعاد (3-D) يستخدم هيدروجيل هيالورونان مرتبط بالتيرامين لتغليف وزراعة بصيلات ما قبل الأنترال من مبيض الفأر. نقوم أيضا بتفصيل طريقتين لحفظ بصيلات المبيض بالتبريد عن طريق التزجيج.

تطبيق هيدروجيل هيالورونان جديد لزراعة البصيلات ثلاثية الأبعاد ومنهجية حفظ بصيلات المبيض بالتبريد في الفأر

تعلم عزل الخلايا الظهارية السلية البشرية باستخدام مادة التربسين الخالية من المنتجات الحيوانية. تضمن هذه الطريقة الامتثال لمعايير التصنيع الجيدة وتناسب التطبيقات السريرية في الطب التجددي.

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

استكشف المزيد من الفيديوهات