الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء الزاعجة المصرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة استجابات الخلايا العصبية الذوقية في الحشرات وقياس التعبير الجيني في الأنسجة الذوقية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تسجيل استجابات الشعر الذوقي المحدد أولا لعدة أذواق بتركيزات مختلفة. الخطوة الثانية هي تشريح الأنسجة الذوقية بعناية.

ثم افصل العينات حسب الجنس والزائدة. بعد ذلك ، قم بعزل الحمض النووي الريبي الكلي من كل عينة من الأنسجة وقم بإنشاء مستحضرات CD NA لتسلسل الجيل التالي و QPCR. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحليل بيانات التعبير الجيني وتشكيل فرضيات ، مثل كيفية توسط الجينات الحسية للعلاج الكيميائي المعبر عنها في الاستجابات الفسيولوجية للأذواق في الحشرات.

في النهاية ، يتم استخدام التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لإظهار النطاق الاستقبالي لنظام تذوق الحشرات ويستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي للأنسجة الذوقية لتسليط الضوء على أهم المكونات الوراثية للاستقبال الذوقي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الأساليب بسبب صغر حجم العلاج الكيميائي للحشرات. الزوائد الحسية.

سواء كان تشريح أو تسجيل من أعضاء الحشرات الصغيرة ، فإن ممارسة المرضى هي مفاتيح إتقان هذه التقنيات. لبدء هذا الإجراء، اسحب قطبا كهربائيا رفيعا للتسجيل في مجتذب ماصة مع شعيرات دموية زجاجية تحت مجهر التشريح. قم بقطع طرف القطب بعناية بحيث تكون فتحته واسعة بما يكفي لتغليف الوسط المستهدف ، ولكنها صغيرة بما يكفي لتجنب ملامسة الهياكل المجاورة.

بعد ذلك ، قم بتخدير اثنين إلى أربع حشرات بالغة في الفريزر عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 ثانية. بعد ذلك ، قم بتثبيت إحدى الحشرات باستخدام زلة غطاء بشرائط صغيرة من شريط السيلوفان. تحت المجهر.

حدد المستشعر المستهدف من خلال مورفولوجيته وموضعه وتوجيه للسماح بالوصول المجاني إليه من زاوية دخول القطب. ثم أدخل سلك التنغستن في الصدر الظهري. ليكون بمثابة قطب أرضي ، املأ القطب الزجاجي من الحافة بمحلول محفز ذي أهمية.

بإخراج فقاعات الهواء أثناء الضغط على الطرف لأسفل. أدخل سلكا فضيا في القطب الكهربائي ليكون بمثابة قطب التسجيل والمحفز. بعد ذلك ، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمكبر صوت مسبق ، مما يسمح بتقليل وقت الاستقرار لالتقاط النشاط العصبي.

يتم توصيل مكبر الصوت المسبق بجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج تسجيل سبايك لجمع الإشارات الكهربائية وتخزينها وتحليلها. الآن قم بتحفيز centum بحل تحكم لضمان وظائفه. عد المسامير بدءا من 200 مللي ثانية بعد قطعة التحفيز الملموسة.

للحصول على نتائج استجابة الجرعة. تعريض الوسط لتركيزات متزايدة من المادة الكيميائية التجريبية والسماح بفترات لا تقل عن ثلاث دقائق بين المحفزات لضمان الانتعاش الكافي. في هذا الإجراء ، قم بإعداد مبرد ضحل بالثلج الجاف.

بالنسبة لأنابيب جمع الأنسجة ، قم بتسمية أنابيب الغطاء المفاجئة الحرة من الحمض النووي الريبي سعة 1.5 ملليلتر لجمع أنواع مختلفة من الأنسجة. حافظ على الأنابيب مغلقة لتجنب التكثيف الزائد. بعد ذلك ، قم بتخدير 30 إلى 40 بعوضا في الفريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 15 إلى 30 ثانية.

ثم انقل البعوض المخدر إلى مرحلة باردة وفرز حسب الجنس. اقلب الجانب الظهري للحشرات لأسفل عن طريق الإمساك بأجنحتها ، مع الحرص على عدم إتلاف زوائد الذوق. تحت مجهر تشريح ، قم بتشريح الملصق المزدوج بيلا أو تارسي من الذكور أو الإناث عن طريق الإمساك برفق للبعوض المحترف Bois القريب من الملصق.

بيلا بزوج واحد من الملقط لكشف القلم الداخلي وإزالة الملصق بالزوج الآخر من الملقط. ثم ضع الأنسجة في أنبوب التجميع البارد للأنسجة الرصغية. أمسك ساق البعوض برفق عند تقاطع الساق والجزء الرصغي الأول ، وقم بإزالة الرسغ.

ثم ضع المنديل في الأنبوب المسمى على البارد. قم بتدوير أنابيب التجميع لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي بدرجة صفر درجة مئوية عند 9 ، 000 مرة من الجاذبية للحفاظ على الأنسجة في قاع الأنبوب. إذا تراكمت الرطوبة في أنابيب التجميع أثناء التشريح ، أضف 50 ميكرولترا من كاشف الثلاث البارد لتغطية وحماية الأنسجة المجمعة.

قم بتجميد الأنابيب في رف الأنبوب سعة 1.5 مل الذي يحتوي على النيتروجين السائل. بعد ذلك ، قم بإعداد المدقات الخالية من الحمض النووي الريبي المثبتة بإحكام عن طريق تبريدها على الثلج الجاف قبل تعطيل الأنسجة. ثم طحن الأنسجة إلى مسحوق ناعم وكرر مرة أخرى.

اجلب الحجم الإجمالي للتريول إلى مليلتر واحد وإعادة الضغط. الأنسجة الأرضية عن طريق الدوامة. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الأنسجة الأرضية واخلطها جيدا.

بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بتدويرها في جهاز الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية عند 11،000 مرة من الجاذبية لمدة 15 دقيقة. أضف الطبقة المائية بعناية مباشرة إلى عمود مرشح الحمض النووي الجيني. ثم قم بتدويرها عند 11،000 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق.

أضف حجما متساويا من الحمض النووي الريبي الخالي من 70٪ من الإيثانول إلى التدفق واخلطه عن طريق سحب العينات. انقل السائل إلى عمود تجميع الحمض النووي الريبي واستمر في استخراج الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، قم بتحديد وتقييم نقاء الحمض النووي الريبي الكلي على مقياس الطيف الضوئي الدقيق والمضي قدما في أي طريقة تسلسل قياسية للحمض النووي الريبي.

توضح التسجيلات التتبع لإمكانات الفعل من الإيلا الذوقية E GTI فعالية التحفيز المباشر مع مجموعة المواد الكيميائية. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد الاستجابات لأي مادة كيميائية محفزة عن طريق حساب طفرات سعة ومدة معينة على مدى زمني معقول أقل من 500 مللي ثانية. تتوافق هذه المسامير الثلاثة مع ثلاثة أنواع فرعية من الخلايا العصبية الحسية ذات الحساسيات المختلفة.

قد تكون التكرارات البيولوجية لمجموعات بيانات RNA-Seq محدودة بتكلفة أو صعوبة جمع الأنسجة. يوفر Q-R-T-P-C-R القدرة على التحقق من صحة مجموعات فرعية صغيرة من التعبير الجيني الكلي بتكلفة أقل ويتطلب مصدرا أقل. الحمض النووي الريبي الموضح في اللوحة اليسرى جنبا إلى جنب هو مقارنة بين التعبير النسبي الذي يحدده RN Aeq والتعبير النسبي الذي يحدده Q-R-T-P-C-R.

تعتمد هاتان الطريقتان على كيمياء مختلفة لتقدير وفرة الجينات. توضح وظائف التكافؤ الإحصائي المعروضة بيانيا في اللوحة اليمنى حدود اليقين في كل حالة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح أنسجة الحشرات لعزل الحمض النووي الريبي وتسجيل الإشارات العصبية من الشعر الذوقي للحشرات الحية.