عزل Potentiated Hsp104 المتغيرات عن طريق الخميرة Proteinopathy نماذج

الهدف من التجربة التالية هو فحص مكتبات HS P 1 0 4 لاختيار المتغيرات التي تثبط سمية البروتينات المرتبطة باضطرابات البروتين الخاطئة. يتم تحقيق ذلك من خلال التحويل المشترك لمكتبات HSP 1 0 4 متغيرة مع ركيزة مرتبطة بالمرض في الخميرة و coex التي تعبر عن البروتينين كخطوة ثانية. تتم معالجة الخميرة المختارة بخمسة حمض فلور أوتيك أو خمسة FOA لمواجهة الاختيار ل HSP 1 0 4 البلازميد.

بعد ذلك ، يتم تسلسل الزيارات عن طريق تضخيم منطقة المطفرات عن طريق مستعمرة PCR أو تحديد الطفرات في جين HSP 1 0 4. في النهاية ، يمكن تقييم قمع سمية الركيزة المرتبطة بالمرض لتحديد متغيرات HS P 1 0 4 الواعدة لمزيد من التوصيف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التحديدات القائمة على الربط ، هي أن هذه التقنية تسمح باختيار المتغيرات التي تثبط سمية الركيزة المرتبطة بالمرض.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طي البروتين من خلال تحديد البروتينات التي يمكن أن تعكس طي البروتين بشكل خاطئ. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتقوية HS P 1 0 4 ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على مكتبات فحص أي بروتين لقمع سمية أي ركيزة سامة في الخميرة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن العديد من المستعمرات قد تحتاج إلى الفحص للعثور على نتائج صالحة للكشف عن قمع سمية البروتيا ابدأ بغسل مستعمرات HSP 1 0 4 من الألواح باستخدام وسائط التسرب المكملة بالرافينوز ، وماصة مصلية وخشب معقم ، وتقوم أدوات التطبيق بنقل غسل السائل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ودوامة المستعمرات جيدا لفصل أي كتل خلايا.

بعد ذلك ، قم بتخفيف تعليق الخلية إلى مزرعة غائمة قليلا وقم بتنمية الخلايا طوال الليل في وسائط تسرب رافينوز مع الاهتزاز عند 30 درجة مئوية. قم بتنمية النوع البري HSP 1 0 4 وعناصر التحكم المتجهة بالتوازي في هذا الوقت أيضا. في لوحة الصباح التالي ، مجموعة من تركيزات الخلايا على ألواح الجالاكتوز الفردية لتوليد صفيحة واحدة على الأقل لكل مجموعة ذات مستعمرات مفردة.

تطبيع المتجه و HSP 1 0 4 ثقافات نوع العالم إلى OD 600 من المكتبة واللوحة. أحجام متساوية من هذه الخلايا مع تركيزات السلالة التجريبية لمقارنة نمو المكتبة بالنسبة لعناصر التحكم لتقييم الاختيار. تقوم الصرامة أيضا بوضع المكتبة على وسائط قمع الجلوكوز ثم احتضان جميع الألواح لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات لاستخدام خمسة FOA لاختيار الخلايا ، والتي لم تعد تحافظ على HSP 1 0 4 التي تعبر عن البلازميدات بعد ذلك تخرج المستعمرات المفردة من كل سلالة مكررة على لوحات وسائط متسربة مزدوجة ومفردة لكل حضانة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.

سيتم استخدام هذه الألواح للتسلسل لاحقا لمنع الجفاف من الألواح. لف لوحات SD الهسهسة Euro في فيلم para وقم بتثبيتها عند أربع درجات مئوية أثناء أداء شاشة FOA الخمسة. ثم قم بربط المستعمرات من لوحات هسهسة SD إلى مستعمرات مفردة على خمس لوحات FOA لمدة يوم إلى يومين عند 30 درجة مئوية حتى تظهر مستعمرات مفردة. مقبل.

من كل خمسة لوحات FOA ، حدد وخط. ثلاث مستعمرات باقية على واحدة SD Euro وواحدة SD صفيحته لكل مستعمرة على قيد الحياة بعد يوم أو يومين آخر من الحضانة عند 30 درجة مئوية. ستنمو المستعمرات التي فقدت بلازميد HSP 1 0 4 على ألواح SD الهسهسة ، ولكن ليس لوحات SD Euro.

قم بزراعة هذه السلالات إلى التشبع في وسائط تسرب الرافينوز في عام 96. عميق بئر اثنين من ألواح المليلتر بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز. ثم للتخلص من أي إيجابيات خاطئة ، قم بإجراء اختبار اكتشاف.

بالقرب من نهاية الحضانة توجد ماصة متعددة القنوات لنقل 200 ميكرولتر من وسائط تسرب الرافينوز لكل بئر إلى لوحة بئر جديدة 96 تحتفظ بالعمودين الأول والسابع للثقافات الأنيقة. بعد ذلك ، قم بتقسيم 250 ميكرولترا من كل من الثقافات المشبعة ال 16 إلى عمودين واحد وسبعة من اللوحة وقم بتخفيف الثقافات بشكل متسلسل خمسة أضعاف في كل عمود من اللوحة ، مع خلطها جيدا مع الماصة متعددة القنوات. ثم لضمان اكتشاف متساو ، قم بإزالة 50 ميكرولترا من الثقافة المخففة من العمود السادس و 12 للتأكد من أن الحجم النهائي لكل بئر هو 200 ميكرولتر.

ثم استخدم أداة مكررة بجهد 96 فولت لاكتشاف الثقافات مكررة على لوحات هسهسة SD و escal hiss. بعد حضانة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 30 درجة مئوية ، حدد سلالات التسلسل التي تظهر سمية على ألواح الهسهسة السريعة. على غرار تلك الخاصة بعناصر التحكم ، فإن السلالات الإيجابية الكاذبة ، والتي ليست سامة مثل الضوابط التي يمكن التخلص منها.

تخلص أيضا من السلالات التي تظهر عليها عيب في النمو على SD. له لوحات أو التي تظهر سمية أكبر بكثير من ركيزة المرض وحدها. لتسلسل المتغيرات HSP 1 0 4 بواسطة مستعمرة PCR أولا كشط ما يقرب من 10 ميكرولتر من الخميرة من ألواح SD همسة اليورو إلى ثلاثة ميكرولتر من 20 مللي هيدروكسيد الصوديوم في أنابيب PCR التي تم تجريدها إلى الخلايا عن طريق تجميد الذوبان.

ضع الشرائح أولا في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد 10 دقائق في الفريزر ، احتضن الأنابيب عند 99 درجة مئوية في جهاز التدوير الحراري لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتخفيف السلالات إلى 100 ميكرولتر بماء من الدرجة PCR باستخدام تركيز أولي عالي. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج PCR قياسي على العينات ، ثم قم بتحليل العينات عن طريق الرحلان الكهربائي لتأكيد تضخيم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بالحجم المناسب.

أخيرا ، قم بتسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع الحرص على تحليل مخططات الكروماتوجرام المتسلسلة للطفرات. يمكن ملاحظة الطفرات كمزيج من نيوكليوتيدات إلى موقع معين حيث غالبا ما تحتوي الخميرة على بلازميدات متعددة. في هذه التجربة التمثيلية ، بعد بناء مكتبة من متغيرات HSP 1 0 4 عشوائية في المجال الأوسط ، تم تحويل المكتبة إلى خميرة تحتوي على بلازميد لتعبير TDP 43 المحفز للجالاكتوز.

ثم تم استرداد المحولات وطلاءها على ألواح الجلوكوز والجالاكتوز لتقييم صرامة الشاشة ، وتم اختيار Hits من لوحة الجالاكتوز. بعد خمس فحوصات لاكتشاف علاج FOA لمجموعة فرعية من المتغيرات المحددة في الشاشة الأولية. أشار إلى أنه من بين المستعمرات الأربع المختارة ، عرضت اثنتان HSP 1 0 4 ، بوساطة قمع السمية TDP 43.

كان أحدهما إيجابيا كاذبا والآخر أظهر سمية معززة. بعد خمسة علاجات ل FOA ، تم بعد ذلك تسلسل الضربتين الحقيقيتين بواسطة مستعمرة PCR لتحديد طفرات المجال الأوسط. يمكن بعد ذلك إجراء طفرات HS P 1 0 4 هذه في البلازميد الأبوي HSP 1 0 4 عن طريق الطفرات الموجهة للموقع لتأكيد قمع سميتها بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لفحص ما يصل إلى 200 ضربة في المرة الواحدة في FO الخمسة ، وهي خطوة على مدار أسبوع إلى أسبوعين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحليل نتائج التسلسل بعناية حيث يتم الحصول على مخاليط من البلازميدات غالبا بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري الفلوري للمساعدة في الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف تؤثر متغيرات HSP 1 0 4 على تجميع الركيزة المرتبطة بالمرض؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص مكتبات متغيرات HSP 1 0 4 لاختيار مثبطات السمية.