على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الفأر القوقعة إإكسبلنتس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير قوقعة جنينية مأخوذة من فأر مراسل فلوري على فترات 30 دقيقة على مدار خمسة أيام. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصاد الأول للقوقعة الجنينية في اليوم 13 من الفئران الفلورية. بعد ذلك ، يتم استزراع القوقعة في المختبر.

ثم يتم وضع ثقافات القوقعة الصناعية في مجهر حاضنة. أخيرا ، يتم إعداد روتين تصوير آلي ويتم تصوير القوقعة E. في النهاية ، يمكن استخدام التصوير بفاصل زمني طويل الأمد لثقافات القوقعة الصناعية لإظهار الحركات المورفولوجية لظهارة القوقعة ككل ، بالإضافة إلى التغيرات في التعبير الجيني للمراسل بمرور الوقت ، وتأثيرات العوامل الدوائية البطيئة المفعول.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية ، مثل التصوير اليدوي لثقافات صندوق X على مدار فترة زمنية هي أن هذا النظام مؤتمت بالكامل. يسمح بجمع المزيد من النقاط الزمنية ، ويضمن تصوير نفس المنطقة من القوقعة الصناعية أو مجموعة الخلايا بنفس الاتجاه في كل نقطة زمنية ، كل ذلك أثناء النمو في حاضنة زراعة الأنسجة غير المنتظمة. بعد استكمال وسط النسر المعدل من KO أو DMEM ومحلول ملح توازن هانك أو HBSS وفقا لبروتوكول النص المصاحب.

تحت غطاء التدفق الصفحي ، استخدم خمسة ملليلتر من DMEM المكملة ب unsu لإعادة تعليق 200 ميكرولتر من ماصة الركيزة الغشائية القاعدية 150 ميكرولتر في وسط كل بئر 10 ملم من طبق ثقافة زجاجي بقطر 35 ملم. احتضن لمدة 40 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 35 درجة مئوية. لتحضير محطة العمل والأدوات ، قم بتشغيل المقعد النظيف للتدفق الصفحي ، واستخدم 70٪ من الإيثانول لرشها ونقع الملقط والملاعق وطبق مطلي بالسيليكون الأسود.

في محطة العمل النظيفة ، حصاد أجنة الحمل المناسب في الجليد. HBSS البارد مكمل ب 1٪ أكوام. باستخدام مجهر ستيريو فلوري ، حدد الأجنة التي تظهر نشاط المراسل خارجيا أو داخل عضو مرئي ونقلها إلى HBSS البارد الطازج مع أكوام 1٪ لجمع العظام الصدغية ، باستخدام مصدر ضوء بارد وملقط دقيق.

اعمل بسرعة لقص فقرات عنق الرحم وأسفل الفك لجمع الرؤوس. بعد جمع رؤوس الأجنة وفقا لبروتوكول النص ، افتح الجمجمة بعناية ، ثم قم بإزالة تقليم الدماغ من مقدمة الرأس وانقل الجمجمة الخلفية إلى طبق به ثلج طازج. برد. أكوام HBSS ، قم بتشريح العظام الصدغية على شكل فول سوداني بعناية ، مع الحرص على الحفاظ على الجهاز الدهليزي سليما.

لتشريح القوقعة ، انقل العظام الصدغية إلى طبق مطاطي من السيليكون الأسود في أكوام HBSS مثلجة. قم بتثبيت المنطقة الدهليزية من العظم عن طريق إدخال دبابيس بزاوية مائلة من أجل تثبيت العظم الصدغي وخلق مساحة للملقط. بعد ذلك ، قم بإزالة الغضروف المحيط بالقوقعة بعناية عن طريق إدخال ربطة عنق واحدة من الملقط في الغضروف عند الحافة الخارجية لقاعدة القوقعة ، وقص ثقب في الغضروف.

قم بقص أفقيا عبر الجزء العلوي وقطريا وارفع الجزء الأمامي من الكبسولة بعناية. أدخل شقة من الملقط بين الغضروف المتبقي والقناة ، وقم بقص الغضروف المتبقي برفق. السطح القمي للقوقعة مكشوف الآن.

بدءا من القاعدة، التقط المنطقة التي يلتقي فيها سقف القناة بظهارة القوقعة الصناعية وافتح قناة القوقعة الصناعية. انزع السقف برفق عند الضرورة حتى يتم إزالته تماما. قم بقص أي أجزاء من الغشاء متبقية على الجانب الإنسي من القناة.

ثم قم بتنظيف القناة من الأنسجة الوسيطة الزائدة وافصل القناة عن الجهاز الدهليزي إلى غرسات المزرعة. ضع سطحا مضيئا واحدا في وسط طبق ثقافة قاع زجاجي مطلي بالركيزة. اسحب السائل بحذر واتركه لمدة دقيقتين.

ثم بالتنقيط. أضف 150 ميكرولترا من DMEM المكملة إلى الخطة X ، مع الحرص على عدم إزعاجها حتى تستقر على الركيزة. ضع الأطباق ذات القاع الزجاجي في طبق بتري عميق قطره 12 سم مع طبق صغير من الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة.

ضع الثقافات في حاضنة 35 درجة مئوية طوال الليل حتى تلتصق الخطة بالركيزة وتسطيحها لإجراء التصوير الحي. بعد اختيار العينات ، استخدم مجهر استريو فلوري لتقييم حالة كل قوقعة مزروعة ، وحدد فقط النباتات الخارجية حيث تكون القناة سليمة وتوصيلها بالزجاج من القاعدة إلى القمة. اضبط الحاضنة على 35 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للثقافة.

تستنشق أنسجة القوقعة الصناعية بلطف DMEM المكمل من الثقافات وتستبدله بما لا يقل عن 500 ميكرولتر ، وهو وسيط جديد. في الحالات التي يتم فيها توصيل المخطط بشكل فضفاض ، قم بوضع ماصة بحلقة متوسطة حول حافة الطبق. سيصنع هذا السائل الإضافي غرفة مرطبة مصغرة دون إزعاج الخطة أثناء استمراره في الالتصاق بالمصفوفة.

المجهر في هذا المثال على منصة دوارة تحتوي على 8 أطباق عينة 35 ملم تحت غطاء التدفق الصفحي. استبدل الأغطية البلاستيكية بأغطية زجاجية وأدخل الأطباق في حامل أطباق العينة. إذا كان من الضروري تغيير الوسائط أثناء التجربة.

لتجنب إزعاج الخطة ، استخدم أغطية الأطباق المفصلية التي تسمح بفتح الأغطية بينما يبقى الطبق في مكانه المناسب في المجهر ، ضع حامل طبق العينة داخل مجهر الحاضنة ، مع الحرص على عدم إخراج المخطط من قاع الطبق أو إزعاج الوسط. لإعداد روتين التصوير ، قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية المجهري والكاميرا ، وافتح برنامج التصوير. لكل عينة موجودة ، اختر مستوى منطقة التصوير للتركيز والتعريض ، مع الأخذ في الاعتبار ليس فقط عرض الخطة في وقت البدء ، ولكن أيضا كيف ستتحرك الأنسجة أثناء الجري.

في قناة التألق ، قم بتعيين مكدس Z يتمحور حول المستوى البؤري المحدد. ثم اضبط تكرار وطول أخذ العينات للتجربة. سيكون هذا محدودا بالوقت المستغرق لجمع الصور لإنشاء فيلم في نهاية فترة الفاصل الزمني.

استخدم برنامجا مثل METAMORPH لفتح ملفات الصور لعينة إطارا تلو الآخر. اختر أفضل مستوى بؤري لإظهار مجموعة الخلايا ذات الاهتمام. أخيرا ، قم بتحويل الصور إلى ملف VI نقطة ، أو قم بتصديرها كمونتاج لإنشاء مجموعة من الصور التي يمكن فتحها وتحليلها في برنامج معالجة الصور أو تحويلها إلى تنسيقات أخرى.

يظهر هنا فيلم يوضح كيف سينمو مخطط القوقعة الصناعية العضوي إذا تم طلاؤه. في E 13.5 ، تم استخدام فأر مراسل SOX لتصور المنطقة الحسية للمحترفين كما هو موضح باللون الأخضر حيث تنقسم خلايا المناطق الحسية غير الحساسة وتتحرك. تخضع المنطقة الحسية غير التكاثرية باللون الأخضر لإعادة ترتيب الأنسجة وحركات التمديد المتقاربة.

توضح تجربة الفاصل الزمني الثانية التي تركز على القاعدة الوسطى لخطة قوقعة صناعية مختلفة أنه مع توسيع الإيجابيات. تضيق المنطقة الحسية عند الدخول لأول مرة في الثقافة. يجعل سمك الأنسجة من الممكن تحديد مناطق التعبير ولكن ليس الخلايا الفردية.

ومع ذلك ، بعد ثلاثة أيام في الثقافة ، تم تسطيح الأنسجة بشكل كبير ، مما يجعل من الممكن تصور الخلايا الفلورية الفردية باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي أو استخراج البروتين والحمض النووي الريبي من أجل تقييم التغيرات في التعبير الجيني على المستوى الجزيئي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح القوقعة واستزراعها وكيفية استخدام مجهر الحاضنة لإجراء تصوير مباشر على كامل الخطة على مدار أيام.