تحديد العوامل الرئيسية تنظيم-تجديد الذات والتمايز في الخلايا المكونة للدم EML السلائف بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المنظمين الرئيسيين المحتملين للتجديد الذاتي لخلايا EML للفأر والتمايز باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي. يتم تحقيق ذلك عن طريق الفصل أولا بين خلايا النسب السلبية CD 34 الإيجابية والنسب السلبية CD 34 خلايا EML السلبية بناء على علامات السطح. الخطوة الثانية هي عزل mRNA وتحويل mRNA إلى (كدنا) وإعداد المكتبة للتسلسل.

بعد ذلك ، تخضع مكتبة الحمض النووي لتسلسل عالي الإنتاجية. الخطوة الأخيرة هي تحليل نتائج التسلسل والبحث عن عوامل النسخ المعبر عنها تفاضليا. في النهاية ، يتم استخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي لإظهار عوامل النسخ المعبر عنها تفاضليا في خلايا النسب السلبية CD 34 الإيجابية والسلابية السلبية CD 34 خلايا EML.

الميزة الرئيسية لتسلسل الحمض النووي الريبي على طرق البرولين الأخرى لتعبير G مثل الأشعة الدقيقة ، هي أنه يتمتع بحساسية أعلى ودقة ونطاق ديناميكي أوسع ، ولا يعتمد على معلومات التعليقات التوضيحية الجينية الموجودة مسبقا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية ، مثل عوامل النسخ الرئيسية التي تنظم التجديد الذاتي للتمايز الذاتي للخلية. يمتد تأثير هذه التقنية إلى حيث علاج أمراض الدم لأن الفهم الأفضل للمنظم الرئيسي الذي يتحكم في خلايا السلائف المكونة للدم ، والتجديد الذاتي والتمايز يمكن أن يؤدي إلى تطوير علاجات فعالة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن أدوات التنسيق الحيوي المختلفة مطلوبة لتحليل التسلسل. يتم زراعة خلايا الهامستر الصغيرة أو خلايا BHK لجمع عامل الخلايا الجذعية في وسط dmem يحتوي على 10٪ FBS في 25 سم مربع ، وقارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من عيون التربسين التقاء وتجمعها عن طريق الطرد المركزي عند 200 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تخلص من snat وأعد تعليق لوحة الخلايا في 10 مل من وسط زراعة خلايا BHK الطازجة.

انقل ملليلترين من تعليق الخلية إلى قارورة جديدة تبلغ مساحتها 75 سم مربع وأضف 48 مل من مزرعة خلايا BHK الطازجة. وسيط لثقافة القارورة. خلايا BHK لمدة يومين.

بعد يومين ، اجمع وسط الثقافة ومرره عبر مرشح نقطة 45 ميكرومتر. قم بتخزين الوسط عند سالب 20 درجة مئوية. يتم زراعة خلايا الفئران الحمراء والنخاعية والخلايا الليمفاوية أو خلايا EML المستخدمة في هذا البروتوكول في تعليق في وسط أساسي EML يحتوي على وسط زراعة خلايا BHK عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

الحفاظ على خلايا EML في كثافة خلية منخفضة مع كثافة ذروة أقل من 600, 000 خلايا في المليلتر. قم بتقسيم الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام بنسبة واحد إلى خمسة ممرات إلى الخلايا برفق ، ولكن لمدة لا تزيد عن 10 أجيال لاستنفاد الخلايا الإيجابية للنسب. حصاد خلايا EML عن طريق الطرد المركزي عند 200 Gs لمدة خمس دقائق.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى بعد التخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في PBS وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي. هناك حاجة إلى عدد الخلايا لتحديد تركيز الجسم المضاد في الخطوة اللاحقة.

اعزل الخلايا السلبية أو السلبية للخط باستخدام كوكتيل الأجسام المضادة للنسب ونظام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لبدء هذا الإجراء ، قم بتدوير الخلايا السالبة عند 200 Gs لمدة خمس دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام PBS وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن الفاكس. بعد الغسيل الثاني ، قم بتكسير الخلايا عند 200 جم لمدة خمس دقائق. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخمسة سعة 1.5 مليلتر بالأرقام 1 و 2 و 3 و 4 و خمسة على التوالي.

أعد تعليق الخلايا بحجم مناسب من الحقائق إلى تركيز 1 مليون خلية لكل 100 ميكرولتر. ثم قم بنقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخمسة. أضف ميكروغراما واحدا من الجسم المضاد CD 34 FE المضاد للفأر إلى الأنبوب الأول والأنبوب الثاني.

امزج الأنابيب واحتضن جميع الأنابيب برفق عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد ذلك ، أضف نقطة 25 ميكروغراما من الأنتيكا المترافقة PE ، وجسم مضاد واحد و 20 ميكرولترا من سلالة مترافقة بجهاز الكمبيوتر. الأجسام المضادة للكوكتيل إلى اثنين واحد ، أضف نقطة 25 ميكروغراما من PE المترافق ضد الجسم المضاد إلى الأنبوب ثلاثة و 20 ميكرولترا من سلالة مترافقة PC.

الأجسام المضادة للكوكتيل في الأنبوب الرابع. امزج الأنابيب برفق واحتضن الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية في الظلام. بعد 30 دقيقة ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الفاكس المؤقت إلى جميع الأنابيب وقم بتدوير الخلايا عند 200 جي لمدة خمس دقائق.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من مخزن الفاكس بعد الغسيل النهائي. قم بتعليق كل حبيبات خلية في 500 ميكرولتر من عازلة الفاكس ، وعزل لين سلبي SCA إيجابي CD 34 إيجابي ولين سلبي SCA سلبي CD 34 خلية سلبية في الأنبوب الأول عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. يتم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا السلبية CD 34 الإيجابية وخلايا CD 34 السالبة باستخدام ثلاثي ويتم إزالة الحمض النووي الملوث باستخدام نوكلياز deoxyribo واحد.

باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، قم بتقييم جودة الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام محلل حيوي باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، يتم استخدام عينات الحمض النووي الريبي فقط برقم سلامة الحمض النووي الريبي أو RIN أكبر من تسعة لاستخراج الحمض النووي الريبي المرسال وإجراءات بناء المكتبة اللاحقة. يوضح هذا الشكل نتيجة عينة RNA عالية الجودة مع RIN يساوي 9.4. بروتوكول بناء المكتبة المستخدم هنا خاص بمنصة تسلسل الحمض النووي الريبي Illumina ويستخدم مجموعة أدوات تحضير عينة الحمض النووي الريبي.

اتبع التعليمات التي قدمتها الشركة المصنعة لأنه يتم عرض الخطوات المحددة فقط في هذا الفيديو. ابدأ باختيار بولي MNA بشكل إيجابي باستخدام الخرز المغناطيسي oligo DT. بعد ذلك ، قم بتفتيت poly mRNA بإجراء نسخ عكسي باستخدام بادئات عشوائية لتحويل mRNA إلى CD NA. بعد ذلك ، يتم استخدام القرص المضغوط الثاني المركب NA لتوليد الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل.

بعد ذلك ، تتم إزالة الأجزاء المتدلية الرئيسية الثلاثة ويتم ملء الأجزاء المتدلية الخمسة بواسطة بوليميراز الحمض النووي. النهايات الأولية الثلاثة لأجزاء CD NA من الربط ببعضها البعض. أضف محولات فهرسة متعددة الإرسال إلى طرفي القرص المضغوط NA المزدوج الذي تقطعت به السبل للتسلسل.

أخيرا ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتخصيب القرص المضغوط NA للشظايا باستخدام مقياس الطيف الضوئي لقياس الامتصاص اثنين 60 على الامتصاص اثنين 80 من الحمض النووي المضخم. للحصول على معلومات حول تركيز المكتبة ، قم بتقييم جودة المكتبة وقياس نطاق حجم شظايا الحمض النووي باستخدام محلل حيوي. تم العثور على طرق تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي في نص البروتوكول المصاحب وتشمل معالجة ملفات البيانات لتحليل المصب ، واكتشاف النصوص الجديدة وتقييم مستوى التعبير ، واكتشاف الجينات المعبر عنها تفاضليا وتحديد عوامل النسخ المعبر عنها تفاضليا.

تم تلطيخ خلايا EML السلبية السلبية بمضادات CD 34 antica one والأجسام المضادة كوكتيل النسب والجمجمة السلبية CD 34 إيجابية و lin سلبية SCA. تم فصل الخلايا السالبة CD 34 السلبية باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت فقط. تم وضع خلايا لين السالبة بوابات لتحليل تعبير SCA one و CD 34.

لوحظ وجود مجموعتين من خلايا EML عند الانتهاء من بناء المكتبة. تم فحص حجم شظايا الحمض النووي في المكتبة باستخدام محلل حيوي. تظهر هذه البيانات التمثيلية مكتبة ذات جودة جيدة ، لكن حجم الجزء يبلغ ذروته عند حوالي 300 زوج أساسي.

تم استخدام خوارزمية D-E-S-E-Q لتحليل التعبير التفاضلي مع التركيز على عوامل النسخ المعبر عنها تفاضليا لأن عوامل النسخ ضرورية لتحديد الكبريتات. تم العثور على عوامل النسخ التي تتغير بأكثر من 1.5 مرة بين لين سالب CD 34 الموجب واللين سالب CD 34 السلبي وتظهر في هذه الخريطة الحرارية. والجدير بالذكر أن مستوى التعبير النسبي ل TCF سبعة في الخلايا الإيجابية CD 34 السالبة أعلى بأكثر من 100 مرة من تلك الموجودة في الخلايا السالبة CD 34 السالبة.

وهكذا تم اختيار TCF سبعة لمزيد من تحليل الترسيب المناعي للكروماتين والتسلسل والاختبار الوظيفي لتأكيد وظيفته في تنظيم التجديد الذاتي والتمايز في خلايا EML. بمجرد إتقان مكتبة الحمض النووي الريبي ، يمكن الانتهاء منها في غضون أيام قليلة ويمكن أن يكتمل الإجراء بأكمله في غضون شهر تقريبا إذا تم إجراؤه بشكل صحيح بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الراغبين في استكشاف التعبير الجيني التفاضلي بين أنواع الخلايا والأنسجة المتنوعة مثل الخلايا البائية والخلايا البائية الخبيثة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام نسبة عالية من CAR TRNA لأنها أساس إجراء الحمض النووي الريبي بأكمله. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية تحديد المنظمين الرئيسيين الذين يتحكمون في تجديد خلايا خلايا EML وتمايزها.