رواية في المختبر نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة التفاعلات بين الدم والخلايا البطانية باستخدام مقايسة جديدة للغرفة البطانية الدموية. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الدم أولا من متطوع سليم عن طريق بزل الوريد في الجهاز المفتوح. في الخطوة الثانية ، يتم وضع الدم بعناية على غرف الدم المطلية بسطح الهيبارين مقترنة بشرائح مطلية بزراعة الخلايا البطانية.

بعد ذلك ، يتم تدوير غرف الخلايا البطانية الدموية هذه بلطف لتسهيل التفاعل بين الدم والخلايا البطانية. في النهاية ، يمكن تقييم تفاعلات الخلية إلى الخلية بين الدم والخلايا البطانية وإنتاج مركب الثرومبين المضاد للثرومبين الناتج عن طريق الفحص المجهري المناعي الفلوري وإليزا على التوالي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل تلك التي تستخدم النماذج الحيوانية هي أنه يمكن هنا استخدام نظام نموذجي بشري للتحقيق في أمراض الأوعية الدموية قبل بدء التجربة.

قم بإقران إبرة تحت الجلد عيار 18 بقطعة قطرها داخلي ملليمترين من أنابيب السيليكون المطلية بسطح الهيبارين. الأسطح البلاستيكية مطلية بالهيبارين لمنع التنشيط غير المحدد للتخثر. على سبيل المثال ، في هذه الصورة ، تظهر جلطة بوضوح في هذه الغرفة غير المطلية.

بعد 30 دقيقة من ملامسة الدم ، تحمي معالجة الغرفة بسطح الهيبارين الدم من التنشيط غير المنضبط ، مما يضمن أن النتائج ترجع إلى تفاعلات دم الخلايا البطانية. فقط بعد توصيل الأنبوب ، قم بجمع عينة دم بعناية من متبرع سليم عن طريق بزل الوريد في نظام مفتوح في أنبوب مطلي بسطح الهيبارين سعة 50 مل. استكمل الدم الذي تم جمعه بالهيبارين غير المجزأ للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 0.75 وحدة دولية لكل مليلتر وقلب الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات للخلط اللطيف.

لتحليل التركيز الأولي لبروتين الدم ، امزج بعناية ملليلتر واحد من الدم لكل أنبوب في أنابيب طرد مركزي دقيقة تحتوي على 30 ميكرولترا من 10 ملليمولار K ثلاثة EDTA ، وضع الأنابيب على الجليد. ثم استخدم طرف ماصة مطلي بسطح الهيبارين لنقل 1.5 مل من الدم إلى كل غرفة من حجرات الخلايا البطانية الدموية المطلية بسطح الهيبارين ، مع الحرص على السماح للدم بالتدفق ببطء ودون تكوين فقاعات لتجنب التنشيط. بعد ذلك ، قم بإزالة الجدران البلاستيكية من شرائح زراعة الخلايا البطانية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واغسل الخلايا البطانية برفق.

باستخدام PBS ، نقوم بنقل أكبر قدر ممكن من الغسيل من الخلايا دون ترك المزارع تجف ونضع الشرائح فوق غرف الدم مع مواجهة الخلايا للدم. ثم استخدام الشرائح البلاستيكية للحصول على دعم إضافي. لتجنب كسر شرائح زراعة الخلايا ، ضع مشبك حول كل غرفة خلية بطانة دموية لتأمين الشرائح.

الآن ، قم بتدوير الغرف على عجلة دوارة في حمام مائي 37 درجة مئوية عند 0.5 جم لمدة 30 دقيقة. بعد الدوران ، قم بتفكيك غرف الخلايا البطانية الدموية ، واغسل شرائح زراعة الخلايا في PBS وقم بتثبيت الخلايا في بارد مثلج 1٪ بارالديهايد لمدة 10 دقائق. أخيرا ، لتقييم تركيز بروتين الدم المنشط ، قم بخلط مليلتر واحد من الدم من كل غرفة في أنابيب طرد مركزي دقيقة تحتوي على 30 ميكرولترا من 0.34 مولار K ثلاثة EDTA ، وضع الأنابيب على الجليد لمدة ساعة واحدة كحد أقصى.

ثم بعد تدوير الخلايا ، قم بتخزين البلازما في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة عند 70 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من التحليل. من المرجح أن يحدث تنشيط عوامل التخثر في الدم الراكد مع زيادة احتمال التفاعل بين العوامل المنشطة. في الواقع ، حجم الدم بدون أي حركة بواسطة فقاعات الهواء أكبر مرتين ونصف.

عند إضافة 1.75 مل من الدم إلى الغرفة مقارنة باستخدام 1.5 مل من الدم ، تشير قيم مضاد الثرومبين المقاس إلى زيادة تكوين مضاد الثرومبين مع زيادة حجم الدم أيضا. ومن المثير للاهتمام ، أنه عندما يتم تحضين ve بأي من حجمي الدم الكامل ، لم يتم ملاحظة أي اختلافات بين المجموعتين مما يشير إلى أن الخلايا البطانية قد تعدل تنشيط التخثر لدراسة تأثير عامل نخر الورم ألفا على تجنيد الكريات البيض. في هذه التجربة ، تم علاج qve ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من TT NF alpha قبل أربع ساعات من ملامسة الدم ، وبعد ذلك تم تحديد عدد الخلايا الإيجابية CD 16.

زاد تجنيد الخلايا الإيجابية CD 16 بشكل ملحوظ مع علاج عامل نخر الورم ألفا من 100 إلى 256 خلايا موجبة CD 16 لكل ملليمتر مربع و 1.5 لتر من الدم ، ومن 172 إلى 378 و 1.75 مل من الدم. ثم تم قياس تكوين مجمعات الثرومبين المضادة للثرومبين في عينات البلازما المقابلة من الدم المحتضن إما بالخلايا المعالجة أو غير المعالجة بعامل نخر الورم ألفا. كما هو متوقع ، أدت الخلايا المحفزة لعامل نخر الورم ألفا إلى مضاعفة تقريبية لمجمعات الثرومبين المضادة للثرومبين مقارنة بالضوابط غير المعالجة بعد تطورها.

ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف واستكمالها وتخثرها في نموذج مختبري باستخدام الخلايا الأولية البشرية والدم البشري الكامل.