Name: رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: اكتشف طريقة قياس نشاط إنزيم PAD4 باستخدام تقنية التوهج الفلوري عالية الإنتاجية. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة دور الإنزيم في الأمراض المختلفة وتطوير مثبطاته.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من خلال حزمة بدء تشغيل جامعة ليهاي. نشكر الدكتور والتر فاست على توفير بلازميد GST-PAD4 للتعبير عن البروتين.

<ol><li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+protein+language+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li>
<li>Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li>
<li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li>
<li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination%3A+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li>
<li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li>
<li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li>
<li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li>
<li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination%2C+gene+regulation%2C+health+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li>
<li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+serological+gap%3A+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li>
<li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PADI4+and+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7(2010).</li>
<li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li>
<li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li>
<li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676(2012).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li>
<li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4+%28PAD4%29%3A+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Discov.+Devel%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+peptidylarginine+deiminase+%28PAD%29+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li>
<li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4%3A+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+design%2C+synthesis%2C+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li>
<li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li>
<li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+citrulline%3A+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching%3A+multicolor+visualization+of+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li>
<li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li>
<li>Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li>
<li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+stabilizes+histone+H2A%2FH2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

هنا ، تم تطوير اختبار قائم على التألق بنجاح يراقب نشاط PAD4. أثبت الاختبار أنه قوي بشكل لا يصدق في عدد من الظروف عالية الإنتاجية وهو متوافق أيضا مع محللات الخليةالكاملة 37.
يتلاشى التقارب بين بروتينات الهيستون وخيوط الحمض النووي المحيطة بها بسبب تحييد الشحنة الموجبة على سلسلة جانب الأرجينين عند الخثار. كان من المتصور أن تحييد سلسلة الأرجينين الجانبية يمكن الاستفادة منها بالمثل لمراقبة نشاط PAD4. من المتوقع أن يقلل تحويل الأرجينين إلى سيترولين بواسطة PAD4 بشكل كبير من قابليته للتحلل ...

يتم تعديل عدد كبير من البروتينات الثدييات بشكل كبير بفعل الإنزيمات التالية الحيوي من البروتينات التي الريبوسوم. ويمكن لهذه التعديلات بعد متعدية (PTMs) زيادة كبيرة في التنوع الوظيفي للبروتيوم عن طريق تغيير حجم، وتهمة، وهيكل، والدولة oligomerization (من بين الميزات الأخرى) البروتينات 1-3. ونتيجة لذلك، فإن التغيير في بنية البروتين يمكن أن يؤدي إلى عواقب فيزيولوجية، مثل تدهور البروتين، التمايز الخلوي، مما يشير، في تعديل التعبير الجيني، وتفاعلات البروتين البروتين. في حين أن هذه التعديلات هي السائدة في نسبة كبيرة من جميع البروتينات البشرية، ومحطة تنتهي في البروتينات هيستون الخضوع لعدد كبير بشكل غير عادي من التعديلات التساهمية 4. البروتينات هيستون هي عائلة من البروتينات الهيكلية التي تسهل التكثيف من الحمض النووي الجيني. وتجرى التعديلات التساهمية من ذيول هيستون غير منظم بها وينظمها دوري الدرجة الاولى الايطاليS من الانزيمات التي يمكن أن تحفز تعديل التساهمية المخلفات (الكتاب)، عكس نفس التعديلات (المحايات)، والتمييز بين التغييرات التي مطبوع على الذيول هيستون (القراء) 5-7. في الواقع، فإن معظم PTMs معروفة يمكن ملاحظتها ضمن هذه الشريحة قصيرة من هيستون بما مثيلة، الفسفرة، أستلة، sumoylation، ubiquitination، وcitrullination 8. Citrullination ينطوي على تحويل ببتيديل أرجينين إلى غير المشفرة ببتيديل ر RNA-سيترولين (الشكل 1A). البروتينات المسؤولة عن هذه السلسلة تحييد الجانب، هم أعضاء في PAD (ص eptide على rginine د eiminase) عائلة بروتين، وكلها تعتمد على الانزيمات الكالسيوم. 9،10. حتى الآن، وقد وصفت خمسة أفراد من عائلة PAD (PAD1، PAD2، PAD3، PAD4، وPAD6). يبدو أن كل عضو من أعضاء هذه الأسرة لاستهداف البروتينات الخلوية متميزة وأيضا يعرض أحاديكيو ملامح توزيع الأنسجة. PAD4 هو العضو الوحيد من هذه العائلة البروتين المعروف أن تكون مترجمة داخل النواة عبر تسلسل توطين النووية 11. تبعا لذلك، فقد تبين أن deiminate عددا من الأهداف النووية، بما في ذلك السلاسل الجانبية أرجينين على ذيول N-الطرفية من الهستونات H2A أرجينين بقايا 3 (H2R3)، H3 (H3R2، H3R17، وH3R26) وH4 (H4R3) 12، 13. في حين أن كل من isozymes PAD لها وظائف فسيولوجية معينة وحاسمة، تلقت PAD4 إيلاءها مزيدا من الاهتمام نظرا لدوره في عدد من العمليات الإنسانية في كل الخلايا المريضة والسليمة. في الآونة الأخيرة، وقد تبين PAD4 أن تكون عضوا في شبكة النسخي تعدد القدرات 14. وعرضت كل من مستويات التعبير PAD4 والنشاط لتكون مرتفعة خلال إعادة برمجة وللدولة الارض الدول المحفزة في الفئران. عن طريق التحكم في تنظيم جينات الخلايا الجذعية، قد PAD4 الاحتفاظ دورا محوريا في كفاءة إعادة برمجة الخلايا. PAD4 كما تم المتورطين فيتشكيل الفخاخ خارج الخلية المتعادلة، التي تقوم عليها ملزمة من مسببات الأمراض تمكين إزالة النظام الخاص بهم. وhypercitrullination من البروتينات هيستون من قبل PAD4 يدفع decondensation من لونين، والتي هي بمثابة المادة الأساسية للتغليف من البكتيريا المسببة للأمراض من فخ خارج الخلية، وبالتالي درء العدوى البكتيرية 15،16. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور PAD4 للعب دور نشط في عدد من الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تبين سابقا أن التعبير المنحرف من PAD4 يرتبط مع بداية وشدة التهاب المفاصل الروماتويدي، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، والتصلب المتعدد 17. في الواقع، فإن وجود الأجسام المضادة بروتين مكافحة citrullinated هو واحد من المؤشرات الحيوية التشخيصية والنذير الأكثر موثوقية ونهائية من التهاب المفاصل الروماتويدي 18. وبالمثل، فقد لوحظ مؤخرا نشاط PAD4 dysregulated في عدد من السرطانات البشرية بما في ذلك المبيض والثدي والرئة، وسرطان المريء د 19-22. وقد تبين الصلة بين PAD4 والسرطان إلى أن توسطت من خلال الجين الورمي ELK1 أو عبر الورم البروتين p53 البروتين القامع 22،23، واقترح العمل السابق الذي PAD4 يمكن أن تكون مضادة للسرطان الهدف العلاجي رواية 17،24،25. كدليل على دراسة المبدأ، تم الكشف عن نضوب PAD4 عبر shRNA في القولون والمستقيم خط الخلايا السرطانية HCT116 أن تكون كافية لإحداث موت الخلايا المبرمج ودورة الخلية اعتقال 26. أدى ضعت مؤخرا لا رجعة فيه PAD4 المانع إلى انخفاض سبعين في المئة في كتلة الورم في الفئران (27). بشكل ملحوظ جدا، ويبدو PAD4 تثبيط لتكون بمثابة العلاج المستهدفة التي أسفرت عن مقتل الانتقائي للخلايا السرطانية في حين أن يجنب الخلايا untransformed. استخدام جزيئات صغيرة لإيقاف وظيفة PAD4 قد يثبت أنه استراتيجية جديدة وقوية لاستهداف الخلايا السرطانية أو لزيادة مبحث المعالجة الكيميائية السرطانية الموجودة 28. للأسف، صوبعد أن اكتشف خيمة PAD4 عكسها المانع. وقد تم تطوير عدد من مثبطات التساهمية باستخدام الكلور / مقبض imidine الفلوري الذي يحاكي الركيزة أرجينين 27،29،30 وأثبتت أنها أدوات عملية في فهم دور PAD4 في كل خلايا الدولة السليمة والمريضة. ومع ذلك، هذه الجزيئات تمنع كل من منصات نشطة مع قوة مماثلة. وبالتالي، فإن الحاجة لفحص سطحي التي تفيد عن نشاط PAD4 أمر بالغ الأهمية. حتى الآن، وقد وصفت PAD4 المقايسات التي تربط الإفراج عن الأمونيا من رد الفعل إلى قراءات اللونية 31، الاستفادة من التناظرية chloroamidine الركيزة fluorescently المسمى لمضان الاستقطاب فحص 32، تعتمد على رد فعل حمض بمساعدة بين الجليوآسال وسيترولين 33، و زوجان النشاط PAD4 إلى مضان dequenching خطوة 34. من هذه، وقد أثبتت هذه الاستراتيجية haloacetamidine معدل التساهمية فقط لتكون متوافقة مع scre عالية الإنتاجيةمنصات ملمسه 32،35،36. نحن تصف فحص سطحي مضان القائم الذي يقيس موثوق نشاط PAD4. الفحص، الذي يعرض نسبة قوية إشارة إلى الضجيج، وسرعة تحليلها، وقياس متانة، لديه القدرة على اكتشاف قوية وانتقائية حقا PAD4 المانع.

<table><tbody><tr><td>مرق LB ، ميلر (LURIA-BERTANI)</td> <td>Amresco</td><td>J106-2KG</td> <td><a href = "http://www.amresco-inc.com/" >http://www.amresco-inc.com< / a></td></tr><tr><td>ampicillin trihydrate (مسحوق أبيض فاتح) ، كواشف فيشر الحيوية</td><td>فيشر Scientific</td><td>BP902-25 &nbsp ؛</td><td><a href = "http://www.fishersci.com/" >http://www.fishersci.com< / أ></td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>جميع الأملاح العازلة&nbsp;</td>يمكن <td>شراء فيشر Scientific</td><td></td><td>من Fisher Scieintifc ؛ VWR. أكروس. سيجما ألدريتش. الخ.</td></tr><tr><td>بروتينو الجلوتاثيون (GSH) agarose&nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>مخزن عند 4 درجات ؛ C; http://www.mn-net.com/</td></tr> <tr><td>كلورو أميدين&nbsp;</td><td>كايمان للكيماويات&nbsp;</td><td>10599</td><td>مخزن عند -20 درجة ؛ C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td> <<td>a href = "http://www.sigmaaldrich.com/" >www.sigmaaldrich.com< / a></td></tr> لوحات <tr><td>Corning / Nunclon MicroWell (96 و 384)</td><td></td><td></td> <td>الشراء من Corning ؛ Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / برنامج</td><td></td><td></td> قارئ الألواح الدقيقة Tecan <td>i-control<a href = "http://www.tecan.com/" >www.tecan.com< / a></td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. مرشح 475/15</td><td></td><td></td> <td><a href = "http://www.perkinelmer.com/" >http://www.perkinelmer.com< / a></td></tr></tbody></table>

رصد القائم على مضان آخر pad4 عبر برو-مضان الركيزة النظير

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

قد تؤدي التعديلات اللاحقة للترجمة إلى تغيير الحالات الوظيفية للبروتين عن طريق زيادة الاختلافات التساهمية على السلاسل الجانبية للعديد من ركائز البروتين. تمثل ذيول هيستون واحدة من أكثر الامتدادات تعديلا بشكل كبير داخل جميع البروتينات البشرية. ثبت أن الببتيديل أرجينين ديميناز 4 (PAD4) يحول بقايا الأرجينين إلى بقايا سيترولين غير مشفرة وراثيا. عدد قليل من المقايسات الموصوفة حتى الآن كانت سهلة من الناحية التشغيلية مع حساسية مرضية. وبالتالي ، من المحتمل أن يكون الافتقار إلى المقايسات الكافية قد ساهم في عدم وجود مثبطات PAD4 غير تساهمية قوية. هنا يتم وصف اختبار جديد قائم على التألق يسمح بمراقبة نشاط PAD4. تم تصميم نظير الركيزة المؤيدة للفلورسنت لربط النشاط الأنزيمي PAD4 بتحرير التألق عند إضافة التربسين البروتيني. وقد تبين أن الاختبار متوافق مع ظروف الفحص عالية الإنتاجية وله نسبة إشارة إلى ضوضاء قوية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا إجراء الفحص باستخدام محللات الخلايا الخام التي تحتوي على PAD4 مفرط التعبير.

في البداية، وقد تبين أن ZRcoum يمكن أن تقدم تقريرا عن نشاط PAD4 في شكل لوحة 96-جيدا. حضنت الآبار مع ZRcoum الركيزة وحضور / غياب PAD4. بعد فترة حضانة المرض من 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وقد تم قياس مضان مع 340/40 - 475/15 نانومتر مرشح (الشكل 2A). كما هو متوقع، ظلت مستويات منخفضة مضان كما fluorophore داخل ZRcoum (أو citrullinated ZRcoum) ظلت في حالة تأمين. عند إضافة فائض التربسين / EDTA إلى حل، كان...

PAD4 هو إنزيم مسؤول عن تحويل الببتيديل الأرجينين إلى الببتيديل السيترولين. كان خلل تنظيم PAD4 متورطا في عدد من الأمراض البشرية. تم وصف مقايسة PAD4 سهلة وعالية الإنتاجية متوافقة مع التألق القائم على الإنتاجية.

رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على معلومات كمية حول مستوى نشاط اللوحة الرابعة في اختبار سهل التكاثر باستخدام التألق. يتم تحقيق ذلك عن طريق حضانة الوسادة الرابعة مع الركيزة التناظرية ZR Co.يتم تحضين البروتين إما في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية للسماح بتحويل مشتق الأرجينين إلى منتج Citraline ، مما يؤدي إلى تعديل تساهمي للركيزة. يضاف التربسين التالي إلى المحلول من أجل توليد فرق إشارة الفلورسنت.تظهر النتائج إضافة الوسادة النشطة الرابعة إلى محلول يحتوي على البروفيسور تؤدي الركيزة الفلورية إلى تغيير تساهمي بناء على انخفاض قابليتها للإصابة بالتربسين وبالتالي انخفاض إشارات الفلورسنت noles. الميزة الرئيسية لتقنيتنا على التقنيات الحالية ، مثل تلك التي تبحث في إطلاق منتج الأمونيا الثانوي المتطاير هي أننا نراقب تعديل الركيزة باستخدام التألق.وسيتم توضيح هذه التقنية من قبل ماري ساكي وجوناثان فييرا لمختبري للعمل مع الوسادة الرابعة أولا تحويل البلازميد pgx الذي يحتوي على وسادة 4G ST اندماج إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا للوسادة أربعة للتعبير عن جميع الخلايا الموجودة على الجليد. ثانيا ، امزج الخلايا الثالثة مع ميكرولتر واحد من بلازميد PGX الذي يحتوي على جين الوسادة الأربعة في أنبوب ثقافة خمسة ملليلتر. احتضن الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق ورجه برفق كل دقيقتين.ثم كل صدمة للخلايا عند 42 درجة مئوية لمدة 40 ثانية. مباشرة بعد الدانتيل ، عاد خليط البلازميد الخلوي إلى الجليد لمدة دقيقتين حتى تتمكن الخلايا من التعافي. أضف الآن ملليلترا واحدا من LB المعقم واحتفظ بالخلايا مبردة لمدة دقيقة أخرى.بعد ذلك ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة. اضبطها على 250 دورة في الدقيقة بعد الحضانة ، وقم بوضع 75 ميكرولترا من الخلايا المحولة على صفيحة أجار مقاومة للأمبيسلين واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. قم بتخزين هذا الطبق على أربع درجات مئوية.نقل مستعمرة من الخلايا التحويلية إلى خمسة ملليلتر من LB تحتوي على الأمبيسلين. ضع الأنبوب في حاضنة ورجه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي.انقل ثقافة البداية سعة خمسة ملليلتر إلى لتر من STO L LB يحتوي على واحد × أمبيسلين ثلاثي. راقب OD 600 من الخلايا أثناء نموها عند 37 درجة مئوية. عندما يصل امتصاصها إلى 0.3.انقل القارورة إلى غرفة 16 درجة مئوية واستمر في الرج. استمر في مراقبة OD للنمو. عندما يصل OD للثقافة إلى 0.6.حث الخلايا ب 0.3 مللي مولار الأيزوبروبيل THAG GTO. اترك الخلايا تهتز لمدة 15 ساعة عند 16 درجة مئوية. من الأهمية بمكان التأكد من أن درجة حرارة النمو عند 16 درجة مئوية قبل بدء التحريض باستخدام IPTG.في اليوم التالي ، يقدم الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة عند صفر درجة مئوية أو خارج عامل SUP وتخزين حبيبات الخلية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لجمع الوسادة. أربعة بروتينات تعيد تعليق حبيبات خلية التحويل في المخزن المؤقت الذي يحتوي على فينول EOL ، وفلوريد ميثيل سوين ، و dihi three etol. بعد ذلك تكمن الخلايا باستخدام الصوتنة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية بعد الطرد المركزي بالصوتنة ، والتحلل عند 20 ، 000 مرة G لمدة 20 دقيقة وعند صفر درجة مئوية.اجمع السوبينات واحتضانها بخرز الجلوتاثيون لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. استنزاف supinate من حبات ضريبة السلع والخدمات عن طريق الجاذبية بعد جمع التدفق من خلال. اغسل الخرزات أربع مرات ب 25 مل من PBS عند أربع درجات مئوية.ثم قم بتصفية الوسادة أربعة بروتين من الخرزات باستخدام 10 ملليلتر من وسادة تركيز العازلة العازلة العليا الأربعة في المخزن المؤقت elucian باستخدام أنابيب الطرد المركزي ذات الوزن الجزيئي 100 كلفن. أخيرا ، قم Eloqua بتقطيع الوسادة المنقاة أربعة بروتين إلى أحجام 200 ميكرولتر للتخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لهذا الإجراء ، قم بإعداد 83 محلول عمل ميكرومولار من محلول ZR المسمى المشترك A. قم أيضا بإعداد المحاليل B و D وحل الوسادة الأربعة C.In تحضير المحلول E ، تأكد من الخلط حتى يذوب TRIPSIN.احصل على صفيحة بئر 384 وقم بتعيين المفكرة وأربعة آبار تحكم وآبار الاختبار وآبار التثبيط للوسادة الرابعة بالإضافة إلى الكلورو أمادين. ثم أضف 25 ميكرولترا من المحلول C إلى كل بئر اختبار و 25 ميكرولترا من D لكل عنصر تحكم. احتضن الطبق جيدا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد 20 دقيقة ، أضف 10 ميكرولتر من المحلول B إلى آبار التثبيط وانتظر 20 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من المحلول A إلى جميع الآبار. ثم انتظر 45 دقيقة.بعد 45 دقيقة ، أضف 10 ميكرولتر من المحلول E إلى جميع الآبار وانتظر 10 دقائق أخرى قبل أخذ قياسات الفلورة. أخيرا ، استخدم قارئا متعدد الوسائط لجمع بيانات الانبعاثات. تم تحضين Zar CO مع وبدون وسادة أربعة لمدة 45 دقيقة بدون الوسادة الرابعة ، وإضافة التريبسين مجانا ، وزيادة مستويات الفلور والفلور ، ويتم تعديل وجود الوسادة الأربعة زار ولا يحرر التربسين الفلور وبالتالي تقليل الفلور.تم اختبار الفحص في ألواح الآبار عالية الكثافة في درجة حرارة الغرفة لاستيعاب إجراءات الفحص عالية الإنتاجية في درجة حرارة الغرفة. لم تتغير الإشارات تقريبا مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها عند 37 درجة مئوية. استمر التفاعل بشكل أبطأ في درجة حرارة الغرفة.تم الانتهاء منه في غضون 45 دقيقة. ثم تم اختبار استقرار PED أربعة في المخزن المؤقت للتفاعل باعتباره ثباتا عاليا مهما للفحص عالي الإنتاجية على مدى 15 ساعة. لم يتم الكشف عن فقدان النشاط الأنزيمي.يظهر تثبيط PLA four بالكلور أمادين الاتجاهات المتوقعة في ظل ظروف الاختبار هذه لدرجة حرارة الغرفة. لتحدي متانة مقايسة PAD four zku ، تم استخدامه لاختبار محللة الخلايا الخام لخلايا الإشريكية القولونية التي تعبر عن وسادة ضريبة السلع والخدمات أربعة. عند اختباره في نفس ظروف وسادة ضريبة السلع والخدمات المنقاة ، لوحظ تألق أربعة كما هو متوقع.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن الوسادة النشطة الرابعة ومراقبة نشاطها باستخدام هذا الاختبار القائم على التألق السهل والموثوق به باستخدام ركيزة مضان البروفيسور.

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

الكيمياء

سنقوم بشرح طريقة الذي يقيس حركية النقل ايون للبروتينات غشاء جنبا إلى جنب مع مواقع محددة تحليل التغيرات متعلق بتكوين باستخدام مضان على الخلايا واحد. هذه التقنية هي قابلة للتكيف مع القنوات الأيونية ، ومضخات نقل أيون ويمكن استخدامها لتحديد المسافة بين القيود مفارز البروتين.

دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) هو تقنية المجهر قوية لمراقبة الوقت الحقيقي من الأحداث يشير في الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار المختلفة وصحفيين. هنا نحن تصف كيفية بناء epifluorescence مخصصة الحنق نظام التصوير من المكونات المتوفرة تجاريا وكيفية استخدامها لتجارب الحنق.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

&lt; p class = "jove_content"&gt; نوضح استخدام الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري (FPALM) لتصوير أنواع متعددة من الجزيئات المصنفة بالفلورسنت داخل الخلايا في وقت واحد. تنتج التقنيات الموصوفة توطين الآلاف إلى مئات الآلاف من البروتينات الفردية المسماة بالفلورسنت ، بدقة عشرات النانومتر داخل الخلايا المفردة.

في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

توفر هذه الورقة طريقة للتحقيق في ديناميكيات حويصلات الناقل العصبي في خلايا الورم الأرومي العصبي ، باستخدام بناء synaptobrevin2-pHluorin والفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي. كما يتم الإبلاغ عن الاستراتيجية التي تم تطويرها لمعالجة الصور وتحليل البيانات.

TIRFM والحساسة للدرجة الحموضة GFP-تحقيقات في تقييم ناقل عصبي الحويصلة حيوية في خلايا SH-SY5Y العصبية: التصوير خلية وتحليل البيانات

نصف تقنية لقياس حركية ربط المستقبلات المفردة المنظمة بالقوة والتصوير في الوقت الفعلي لإشارات الكالسيوم في الخلايا الليمفاوية التائية واحدة.

مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

في القلب، والأحداث الجزيئية تنسيق وظيفة الكهربائية ومقلص من الجهاز. وهناك مجموعة من تقنيات المجهر مضان ميدانية محلية المعروضة هنا يمكن تسجيل المتغيرات الخلوية في قلوب سليمة. تحديد آليات تحديد وظيفة القلب أمر بالغ الأهمية في فهم الكيفية التي يعمل بها القلب في حالات المرضية.

محلي الميدان مضان المجهر: التصوير الإشارات الخلوية في قلوب سليمة

وسم المجال خارج الخلية من بروتين الغشاء مع fluorophore حساسة درجة الحموضة، superecliptic pHluorin (سبتمبر)، ويتيح توطين التحت خلوية، والتعبير، والاتجار يحدد لاحقا. البروتينات التصوير سبتمبر وصفت مع الانعكاس الكلي الداخلي مضان المجهر (TIRFM) تمكن الكمي لمستويات البروتين في الطرفية ER والبلازما الغشاء.

باستخدام مستقبلات الموسومة pHluorin لمراقبة التحت خلوية التعريب والاتجار

هنا يصف لنا تحليل القائم على الأسفار الفائق تدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة من خلال تحليلات فلوروميتريك والتصوير في الخلايا الحية. يمكن استخدام هذا الفحص لفحص المخدرات أو الجينات المستهدفة التي تنظم إعادة ختم غشاء البلازما في خلايا الثدييات.

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

يتميز تنشيط Ser/Thr kinase AURKA متعدد الوظائف بفسفرته الذاتية على Thr288. يمكن لمجسات الفلورسنت التي تعتمد على FRET التمييز بين حالاتها غير النشطة والمنشطة. هنا ، نوضح بعض الاستراتيجيات لهندسة المسبار ، جنبا إلى جنب مع بروتوكول FRET السريع لمتابعة تنشيط كيناز في جميع أنحاء الانقسام.

المراقبة في الوقت الحقيقي لتنشيط Aurora kinase A باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET التوافقية في الخلايا الحية

يصف هذا البروتوكول إعداد العينات وتحليل البيانات لتحديد كمية فسفرة البروتين باستخدام فحص محسن للسحب أحادي الجزيء (SiMPull).

اختبار محسن للسحب أحادي الجزيء لتحديد كمية فسفرة البروتين

يوضح البروتوكول المقدم في هذه الدراسة فعالية كاشف الفرق cAMP في الموقع  في قياس cAMP من خلال طريقتين. تستخدم إحدى الطرق مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا مع خلايا HEK-293. توضح الطريقة الأخرى خلايا HASM الفردية تحت مجهر الفلورسنت.

ديناميكيات cAMP في الوقت الفعلي في الخلايا الحية باستخدام كاشف فرق cAMP الفلوري في الموقع

اكتشف طريقة قياس نشاط إنزيم PAD4 باستخدام تقنية التوهج الفلوري عالية الإنتاجية. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة دور الإنزيم في الأمراض المختلفة وتطوير مثبطاته.

رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير

استكشف المزيد من الفيديوهات