تقييم التفاعلات الكريات البيض البطانية تحت ظروف التدفق في فيفو السابقين الفحص Autoperfused غرفة Microflow

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء دائرة شريانية وريدية مغلقة خارج الجسم الحي لتقييم تفاعلات الكريات البيض مع جزيئات الالتصاق البطاني في ظل ظروف التدفق الفسيولوجي. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء غرفة زجاجية رقيقة أولا بجزيء الالتصاق البطاني ذي الأهمية. في الخطوة الثانية ، يتم توصيل أنابيب البولي إيثيلين والسيليكون بالغرفة ثم جراحيا بالماوس.

الدم التالي من الشريان السباتي كما يسمح بالتدفق عبر الأنبوب. ويتم تسجيل التفاعلات اللاحقة للكريات البيض الأصلية مع الغرفة الزجاجية المطلية في الوقت الفعلي. في النهاية ، يمكن حساب تأثيرات العلاجات المختلفة على إزاحة وسرعة التدحرج للكريات البيض حيث تتفاعل مع جزيئات الالتصاق المجمدة بمرور الوقت.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنية الحالية مثل تحليل القياس الخلوي الاحترافي ، هي أنه باستخدام هذه التقنية ، يتم تقييم تفاعل الكريات البيض مع جزيئات البطانية في ظل ظروف التدفق الفسيولوجي. في اليوم السابق للتجربة ، قم بتوصيل سنتيمتر واحد من أنابيب البولي إيثيلين PE 10 بقطعة من أنابيب السيليكون التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات ، متبوعة بخمسة سنتيمترات من أنابيب البولي إيثيلين. لإعداد إعداد الأنبوب للجانب الوداجي للحيوان للجانب السباتي ، قم بتوصيل الأنبوب كما هو موضح للتو بإضافة TTU داخل أنبوب السيليكون الذي يبلغ طوله ستة سنتيمترات ، على بعد حوالي 1.5 سم من أنبوب البولي إيثيلين الذي يبلغ طوله سنتيمتر واحد.

بعد ذلك ، قم بتوصيل أحد طرفي قطعة 10 سم من أنابيب السيليكون بمحول الضغط وأدخل الطرف T لأنبوب T الجانبي السباتي في الطرف الآخر. تأكد من أن مواقع الاتصال ضيقة وخالية من التسرب. ثم استخدم حقنة سعة مليلتر واحد متصلة بإبرة قياس 25 لغرس كل غرفة تدفق دقيق ببروتين طلاء السطح البطاني المحضر حديثا محل الاهتمام ، وقم بتخزين الغرف المطلية في أنبوب سعة 15 مليلتر عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها في اليوم التالي.

لتوصيل الأنبوب الوداجي والسباتي بغرفة التدفق الصغير ، قم بتوصيل أنبوب سيليكون بحجم سنتيمتر واحد بكل جانب من جوانب الغرفة ، ثم أغلق الوصلات بقطعة صغيرة مستطيلة الشكل من البارم ممتدة مع الأنبوب الذي يلتقي بالغرفة. استخدم حقنة لملء الحجرة والأنبوب بألبومين مصل بقري بنسبة 0.1٪. ثم بعد التحقق من وجود تسرب ، احتضن إلى الغرفة لمدة 45 دقيقة.

في درجة حرارة الغرفة بالقرب من نهاية الحضانة ، قم بتثبيت غرفة التدفق الصغير على درجة إلى طبق بتري بقطرة صغيرة من السيليكون في كل شق. ثم قم بتوصيل الأنابيب الوداجية والسباتية بكل جانب من جوانب الغرفة. ثم أثناء تجفيف السيليكون ، قم بتوصيل حقنة قفل 60 مل مملوءة بالهيبارين بمحول الضغط وقم بتشغيل 100 هيبارين بدرجة USP من خلال الأنبوب والغرفة حتى لا تكون هناك فقاعات هواء.

قبل توصيل الماوس بغرفة microflow ، قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر وجهاز تسجيل الضغط المناسب. بمجرد إعداد البرنامج ، قم بتأمين ماوس عمره 10 إلى 12 أسبوعا. في الوضع البطني ، قم بعمل شق في منطقة الرقبة بالمقص ثم قم بتشريح الغدة الدرقية لكشف القصبة الهوائية والأوعية.

نظف الشريان السباتي حتى يتعرض بالكامل. الحرص على عدم إتلاف العصب المبهم. ثم مرر منحنى قطعة مطوية من الخيط أسفل الشريان السباتي وقطع الخيط عند الانحناء.

لذلك هناك قطعتان من الخيط تحت الشريان. قم بلف كل خياطة في عقدة دون شد ، ثم ضع الغرز للوريد الوداجي الأيسر بنفس الطريقة. عندما تكون الغرز الوداجية في مكانها ، قم بحقن ملليلتر واحد من الهيبارين في IP للفأر.

بعد الحقن ، شد الخيط العلوي على الشريان السباتي وضع مشبك الوعاء الدموي منخفضا قدر الإمكان على الجزء المكشوف من الشريان. استخدم الملقط لتثبيت الشريان من الخيط العلوي ثم استخدم مقصا دقيقا دقيقا لعمل شق صغير حوالي ثمن محيط الشريان بالقرب من الخيط العلوي. الآن أدخل أنبوب الشريان السباتي باستخدام حامل أنبوب من خلال الشق الذي تم إجراؤه في الشريان وقم بتمريره بواسطة الخيط السفلي.

ثم اربط الخيط السفلي متبوعا بالخياطة العلوية. لذلك يتم إغلاق الشريان حول الأنبوب ، مما يجعل عدة عقدة لضمان إحكام الإغلاق. بعد تكرار نفس الإجراء للأنبوب الوداجي ، باستثناء مشبك الوعاء ، افتح مؤقتا مشبك الوعاء على أنبوب الشريان السباتي لاختبار التدفق.

إذا لم يكن هناك تسرب ، فقم بنقل الماوس إلى المجهر وقم بتوصيل أنبوب الشريان السباتي والوريد الوداجي بأنبوب غرفة التدفق الدقيق لتسجيل سرعة تدحرج الكريات البيض من خلال غرفة التدفق الدقيق. حرر المشبك السباتي بالكامل لملء الغرفة. اسمح للدم بالدوران لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى تستقر ظروف التدفق.

في غضون ذلك ، اضبط مرحلة المجهر بحيث تكون الغرفة مستوية مع هدف المجهر وتكون حافتها موازية لنافذة تسجيل الفيديو على الشاشة. بعد ذلك ، قم ببناء طبق بتري بماء بدرجة حرارة الغرفة ، ثم قم بخفض هدف الغمر بالماء 10 × في الطبق بحيث تكون الخلايا المتدفقة عبر الغرفة مرئية ، وضبط شدة الضوء حسب الاقتضاء لمحاكاة ضغط تدفق فسيولوجي متوسط ، واضبط المشبك الموجود على الأنبوب بحيث يقرأ محول الطاقة 30 ملم ثابت من الزئبق. ثم اضغط على ابدأ لبدء تسجيل كل من تهريب الكريات البيض والضغط مع الفاصل الزمني الأول بالقرب من الطرف الوداجي للغرفة والتحرك عكس التدفق نحو نهاية الشريان السباتي حتى يكتمل.

عند الانتهاء من التسجيل ، أغلق الصمام في موقع الإدخال لإيقاف تدفق الدم واستبدل الغرفة بغرفة جديدة مغلفة بجزيء التصاق مختلف إذا رغبت في ذلك. خلال كل تسجيل ، تظهر الكريات البيض المتفاعلة فقط داخل الغرفة. على سبيل المثال ، في كل صورة من هذه الصور ، تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى الكريات البيض الفردية التي تم التقاطها بواسطة جزيء الالتصاق ذي الأهمية والتي تتدحرج على طول الغرفة بين الخلايا الأخرى المتدفقة بحرية.

داخل تدفق الدم ، يمكن رؤية قطعة أثرية شائعة خارج الغرفة مع الكرات المظلمة الكبيرة في جميع الصور ، والتي يمكن أن تساعد المشاهد على تقدير حركة الكريات البيض فيما يتعلق بنقطة ثابتة. يوضح الرسم البياني مخططا نهائيا للبيانات. لوحظ أن العلاج التجريبي الأول يقلل من سرعة التدحرج الواضحة كتحول إلى اليسار ، ولوحظ أن العلاج التجريبي الثاني يزيد من السرعة التي تظهر على شكل تحول إلى اليمين ، مقارنة بسرعة التدحرج للتحكم بالاشتراك مع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طريقة أخرى مثل تسمية الكريات البيض و vivo x Viva لمزيد من الإجابة على أسئلة أخرى مثل مساهمة بعض تطور مرض النوع الفرعي من الكريات البيض