مضان استنادا تمديد التمهيدي تقنية لتحديد ما الترانسكربتي المنطلقات ومواقع الشق من RNases في فيفو

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد نقاط البداية النسخية ومواقع انقسام الحمض النووي الريبي في الجسم الحي من البكتيريا باستخدام تفاعل تمديد التمهيدي الفلوري. يتم تحقيق ذلك عن طريق نمو البكتيريا أولا مثل الإشريكية القولونية أو S aria ، وعزل جزيئات الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، يتم نسخ الحمض النووي الريبي بشكل عكسي باستخدام بادئات فلورية محددة ونسخ عكسي ينتج عنه شظايا CD NA.

ثم يتم عزل الحمض النووي أو البلازميدات من الخلايا البكتيرية ، ويتم إنشاء سلم تسلسل سانجر الفلوري من قالب الحمض النووي باستخدام مجموعة التسلسل. أخيرا ، يتم فصل شظايا CDNA وسلالم التسلسل واكتشافها في وقت واحد على هلام بولي أكريلاميد باستخدام جهاز تسلسل هلام آلي ومقارنتها ببعضها البعض. في النهاية ، يتم استخدام امتداد التمهيدي الفلوري لرسم خريطة للنهايات الأولية الخمسة لجزيئات الحمض النووي الريبي حتى دقة قاعدة واحدة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى مثل الامتداد الأولي القائم على العرق أو النشاط الإشعاعي هي التعرف السريع على الخمسة من نهايات جزيئات الحمض النووي الريبي حيث يحدث الاكتشاف في وقت واحد أثناء الرحلان الكهربائي. تشبه الحساسية الامتدادات الأولية القائمة على النشاط الأحمر ، ولكنها تمكن موظفي المختبر من استخدام هذه الطريقة دون الحاجة إلى تدريب على السلامة الإشعاعية لنشاط المعدل. لقد استخدمنا بنجاح تقنية التمديد الأولية الفلورية هذه للتحقيق في مكونات الحمض النووي الريبي لأنظمة مضادات السموم المضادة للسموم.

المكورات العنقودية التي توضح الإجراء هي كريستوفر شوستر ، طالب دراسات عليا من مختبري. بعد تحضير إنتاجية عالية من الحمض النووي الريبي وتصميم البادئات وفقا لبروتوكول النص ، قم بإجراء تفاعل تمديد التمهيدي عن طريق التسخين المسبق للجهاز التدوير الحراري أولا إلى 95 درجة مئوية. لكل عينة من عينة الحمض النووي الريبي ، امزج المركبات التالية في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وقم بتغيير طبيعة العينات لمدة دقيقة واحدة عند 95 درجة مئوية.

ثم ضع الأنابيب على الجليد لمدة خمس دقائق لتهجين البادئات والحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، اضبط جهاز PCR على 47 درجة مئوية. ثم قم بإعداد مزيج النسخ العكسي الرئيسي كما هو موضح هنا.

أضف أربعة ميكرولترات ، وهو مزيج رئيسي للنسخ العكسي لكل عينة من الحمض النووي الريبي المهجن واحتضان الأنابيب لمدة ساعة واحدة عند 47 درجة مئوية. لإيقاف التفاعل ، سخني العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. ثم أضف ستة ميكرولترات من صبغة تحميل الأميد وخزنها طوال الليل أو لمدة تصل إلى أسبوعين في الظلام عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد تحضير الحمض النووي الجيني أو البلازميدات ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتجميع تفاعل تسلسل سانجر عن طريق خلط 12 ميكرولترا من حوالي 10 إلى 15 ميكروغراما من الحمض النووي الجيني أو 100 إلى 500 نانوجرام من الحمض النووي البلازميدي مع ميكرولتر واحد من التمهيدي المسمى بالفلورسنت وميكرولتر واحد من ماصة DMSO. ميكرولتر واحد من كل مزيج من التسلسل في أنابيب PCR منفصلة مسبقة التصنيف. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من مزيج التمهيدي D-N-A-D-M-S-O إلى كل أنبوب.

اضبط جهاز PCR على البرنامج التالي وقم بتشغيله بعد وضع العينات في الجهاز. بعد التشغيل ، أضف ستة ميكرولترات من صبغة التحميل إلى العينات ثم على الثلج. إذا كنت تستخدم على الفور أو عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر على المدى الطويل باستخدام ألواح نظيفة خالية من الغبار يبلغ طولها 25 سم ، فضع فواصل 0.25 ملم على اللوح الزجاجي الخلفي وقم بخفض اللوحة الزجاجية المسننة في الأعلى بحيث يكون الطرف المحزز للألواح الزجاجية وطياري دخول السكك الحديدية متجها لأعلى.

قم بتوصيل قضبان الجل على جانبي الألواح الزجاجية وشد المقابض برفق لصب الجل. امزج المركبات المدرجة هنا في دورق مع شريط تحريك وضعها على طبق تحريك مغناطيسي. مباشرة بعد إضافة PS وتعاونه ، استخدم حقنة سعة 50 مليلتر لتناول محلول الأكريلاميد ووضع مرشح 0.45 نانومتر على الحافة.

ضع الألواح المحصورة بزاوية 10 إلى 20 درجة وقم بتوزيع محلول الجل ببطء بين الألواح الزجاجية مع تحريك طرف المحقنة باستمرار من جانب إلى آخر. توقف عن توزيع محلول الجل بمجرد أن يلتقي بالطرف السفلي من الألواح الزجاجية. باستخدام خطاف الفقاعات ، قم بإزالة أي فقاعات قد تكون قد تشكلت.

ثم حرك فاصل جيب الجل بين الألواح الزجاجية في الطرف المحزز ، واغمرها في محلول الجل ، وقم بتثبيتها عن طريق ربط لوحة الصب برفق بربط مسامير السكك الحديدية العلوية واترك الجل يتماسك لمدة ساعة إلى ساعتين. قبل إزالة لوحة الصب وفاصل الجيب ، استخدم الماء المقطر منزوع الأيونات لتنظيف الجيب من الملح وبقايا الجل لتشغيل الجل. حرك حامل الخزان العازل في قضبان الجل على الألواح الزجاجية الأمامية وشد المقابض.

ضع الجل في خزان الجل السفلي لجهاز تصوير الجل الآلي مقابل لوحة التسخين وقم بإصلاحه عن طريق تحريك دليل دخول السكك الحديدية في أقواس الجهاز. استخدم عازلة XTBE واحدة لملء الغرف العازلة للهلام العلوية والسفلية. ثم أغلق الغرفة العازلة السفلية واستخدم سلك الطاقة لتوصيل الغرفة العازلة العلوية بالطاقة.

إذا كان الملح موجودا في جيب الجل ، فاستخدم المخزن المؤقت لوضع الماصة بشكل متكرر في الجيب لتنظيفه. ثم استخدم الغطاء العلوي للخزان العازل لإغلاق حجرة الخزان العازلة العلوية. بعد تشغيل جهاز التصوير والكمبيوتر وبدء تشغيل برنامج جمع بيانات الأشعة تحت الحمراء للصورة الأساسية وفقا لبروتوكول النص ، استخدم الإعدادات المدرجة هنا لإعداد عنصر التحكم في الماسح الضوئي.

بعد ذلك ، قم بتشغيل الجل الفارغ مسبقا لمدة 20 دقيقة عن طريق تحديد الجهد والضغط على enter. في غضون ذلك ، باستخدام جهاز PCR ، قم بتسخين سلم التسلسل ومنتجات تمديد التمهيدي إلى 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين قبل التبريد على الجليد ، أوقف الرحلان الكهربائي ، وافتح جهاز التسلسل الجل الآلي وقم بإزالة غطاء الخزان العلوي للخزان العازل. ثم أدخل مشط أسنان القرش بين الألواح الزجاجية وأسنان سمك القرش.

اخترق ماصة الجل قليلا من واحد إلى اثنين ميكرولتر من منتجات تمديد التمهيدي أو تفاعلات سلم التسلسل في كل جيب جل. لأي جيوب فارغة. استخدم صبغة التحميل لملئها لمنع سلوك التشغيل غير المتسق ، وأغلق الخزان العازل وباب جهاز تسلسل الجل.

ثم ابدأ الرحلان الكهربائي عن طريق تحديد الجهد لتشغيل حالة المسح الضوئي بالليزر والضغط على Enter. بمجرد اجتياز منطقة الاهتمام لليزر ، أوقف الرحلان الكهربائي كما هو موضح هنا. يمكن استخدام تفاعل التمديد التمهيدي لتحديد نقاط البداية النسخية أو TSP للنصوص ذات الأهمية ويمكن أن يساعد في استنتاج مناطق المروج.

في هذا المثال ، تم تحديد TSP ل MPE mRNA على أنه G بما يتفق مع البيانات المنشورة سابقا. تم استنتاج أن عناصر المحفز سالب 35 وناقص 10 هي T-T-G-T-A-A و T-A-G-A-C-T ، وتختلف هذه الزخارف فقط إلى القواعد من كل تسلسل من تسلسلات الإجماع الخاصة بها باستخدام امتداد التمهيدي لتحديد منتجات انقسام الرنا المرسال. يظهر هنا رسم خرائط الحمض النووي الريبي للانقسام القريب من START co بواسطة RNA Ybi SEC two عندما لا يكون الحمض النووي الريبي موجودا أو غير نشط ، ولا يتم تشكيل منتجات تمديد أولية بالقرب من البداية نتيجة لنشاط الحمض النووي الريبي.

ومع ذلك ، يظهر شريطان قويان في اتجاه مجرى مجرى طبقة البداية في هذا الشكل يظهر تجربة تمديد أولية فاشلة بسبب الحمض النووي الريبي الزائد في تفاعل النسخ العكسي الذي يمنع تحديد النطاقات الفردية. يوضح هذا أنه يجب تعديل الكمية الإجمالية للقالب من الحمض النووي الريبي حسب وفرة الحمض النووي الريبي المهم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توضيح نقاط البداية النسخية ومواقع انقسام الحمض النووي الريبي في الجسم الحي باستخدام بادئات الفلورسنت وجهاز تسلسل هلام آلي مع بعض الممارسة.

هذه الطريقة سريعة وسهلة التنفيذ. حظا سعيدا في تجاربك.