Why do neuroscientists use primary neuronal cultures instead of studying the whole brain?

The brain's complexity makes it difficult to manipulate and observe individual neurons directly. Primary neuronal cultures provide a simpler, controllable system where neurons are easily accessible for experimental tools and techniques. This allows researchers to study specific cellular phenomena like protein trafficking and electrophysiology without the complications of intact brain tissue.

What are the main steps involved in preparing primary neuronal cultures?

Primary neuronal culture preparation involves four major steps: dissection of nervous system tissue from an organism, dissociation into single cells using enzymes and trituration, plating cells in culture media on treated surfaces, and maintenance through regular media replacement. Each step is critical to ensure cell viability and successful culture growth in a sterile, warm incubator environment.

How does dissociation break down tissue into individual neurons?

Dissociation uses both chemical and mechanical methods. First, proteolytic enzymes like trypsin or papain digest the extracellular matrix proteins binding cells together. After enzyme removal, trituration—passing tissue through a pipet multiple times—physically separates cells into a single cell suspension. Trypan blue staining then assesses cell viability before plating.

Why must glass coverslips be treated before plating neurons?

Neurons cannot grow directly on untreated glass surfaces. Coverslips are pretreated to improve cell attachment and growth through coating with synthetic extracellular matrix proteins like poly-lysine and laminin, or by acid etching to roughen the surface. These treatments create a more favorable substrate for neuronal adhesion and development.

How can genetic manipulation be used to study protein trafficking in cultured neurons?

Neurons are transfected with DNA encoding a protein of interest fused to a fluorescent protein like green fluorescent protein (GFP). Live imaging then tracks the movement and localization of the fluorescently-tagged protein throughout the neuron. This approach reveals how proteins such as neurotransmitter receptors are trafficked to specific cellular structures.

What makes primary neuronal cultures ideal for electrophysiology experiments?

The single layer of neurons in culture allows individual cells to be easily targeted with microelectrodes for measuring electrical activity. Manipulations like pharmacological treatments are quickly and evenly applied across the culture. The patch clamp electrophysiology principle applications enable researchers to measure how test compounds affect single neuron activity in a controlled environment.

What tissue sources can be used to create different types of primary neuronal cultures?

Various nervous system tissues from multiple developmental stages can be cultured. Specific brain regions like the cerebellum, cortex, and hippocampus produce different neuronal types. The spinal cord and peripheral nervous system components such as dorsal root ganglia can also be dissected and cultured. Embryos and perinatal tissue are preferred because immature brain cells are less susceptible to damage.

مزارع عصبونية أولية

0 مشاهدة08:43 دقيقة

يُعد الدماغ أحد أكثر أعضاء الجسم تعقيداً، لذا غالباً ما يحتاج علماء الأعصاب إلى نظام أبسط لإجراء التلاعبات والملاحظات التجريبية. وتُعتبر زراعة الخلايا أحد هذه الأنظمة التي تتيح وصولاً سهلاً إلى العصبونات الحية. وبشكل عام، تتضمن زراعة الخلايا تنميتها في محاليل خاصة تسمى أوساط الزراعة ضمن بيئة معقمة وقابلة للتحكم، وعادة ما تكون حاضنة دافئة. أما المزرعة الأولية فهي تلك التي يتم إنتاجها من أنسجة مستأصلة من كائن حي. ويمكن إنشاء أنواع مختلفة من المزارع العصبونية الأولية من مجموعة متنوعة من الحيوانات، والمراحل التطويرية، وأنسجة الجهاز العصبي.

سيوفر هذا الفيديو مقدمة عن طريقة إنتاج المزارع العصبونية الأولية وبعض التجارب التي تستخدم هذه الخلايا بشكل شائع.

يمكن استخدام العديد من النماذج الحيوانية الهامة في أبحاث العلوم العصبية لتحضير مستنبتات عصبية أولية. وفي حالة الفئران والجرذان - وهما من أكثر الثدييات استخداماً في الأبحاث الطبية الحيوية - يمكن تشريح الأنسجة العصبية من الأجنة، وجراء حديثي الولادة، والبالغين لغرض الاستنبات. وعادة ما يُفضل استخدام الأجنة والجراء في الفترة المحيطة بالولادة لأن الخلايا الدماغية تكون غير ناضجة وأقل عرضة للتلف.

يمكن عزل أنسجة مختلفة من الجهاز العصبي واستخدامها لإنتاج أنواع مختلفة من المستنبتات العصبية الأولية. على سبيل المثال، يمكن تشريح أجزاء محددة من الدماغ، مثل المخيخ، والقشرة المخية، والحصين. كما يمكن تشريح النخاع الشوكي أو مكونات الجهاز العصبي المحيطي، مثل عقد الجذور الظهرية، واستنباتها لتنمية أنواع محددة من العصبونات.

وبغض النظر عن مصدر النسيج، يمكن تلخيص الطريقة العامة لإنتاج المستنبتات العصبية الأولية في بضع خطوات رئيسية هي: التشريح، والتفكيك، والزرع، والصيانة.

لنبدأ مراجعة متعمقة لهذه الخطوات بالخطوة الأولى: التشريح. عند التحضير لخطوات التشريح والزراعة، تعد التعقيم أمراً بالغ الأهمية لمنع تلوث المزارع. يجب تعقيم الأدوات باستخدام الكحول، وغالباً ما يتم استخدام غطاء التدفق الصفائحي لإزالة الملوثات المنقولة جواً.

لأغراض زراعة العصبونات القارضات، ينبغي استئصال الأنسجة من الحيوانات التي تم القتل الرحيم لها حديثاً ووضعها في محلول ملحي منظم بارد. وباستخدام مجهر تشريحي، يمكن عزل أجزاء أصغر من النسيج -مثل الحصين- بعناية لإجراء مزيد من المعالجة.

بعد ذلك، من الضروري تفكيك العينة إلى مكوناتها الخلوية في عملية تُعرف باسم التفكيك (dissociation). يتم أولاً فرم النسيج المستأصل باستخدام مشرط أو مقص، ثم تُنقل قطع النسيج الناتجة إلى وعاء جديد. يُضاف بعد ذلك إنزيم محلل للبروتينات مثل trypsin أو papain لهضم بروتينات المصفوفة خارج الخلية التي تربط الخلايا ببعضها البعض. وبعد فترة حضانة قصيرة في حاضنة دافئة أو حمام مائي، تُغسل قطع النسيج برفق باستخدام محلول منظم (buffer) لإزالة الإنزيمات.

يمكن الآن تفكيك قطع النسيج الرخوة عن طريق التفتيت الميكانيكي (trituration)، والذي يتضمن تمرير النسيج عبر ماصة عدة مرات بحيث تتحرر الخلايا لتكوين معلق خلوي مفرد. وفي هذه المرحلة، يمكن عد الخلايا لتحديد التركيز والتحقق من حيويتها باستخدام صبغات مثل Trypan blue، مما يساعد في تحديد مدى التخفيف المطلوب للمعلق لضمان نمو ناجح.

وأخيرًا، أصبحت الخلايا العصبية جاهزة للاستزراع! لنراجع بعض التدابير الهامة التي يجب اتخاذها للحفاظ على حيويتها وصحتها. إن تركيب أوساط الاستزراع المستخدمة لتنمية الخلايا العصبية أمر بالغ الأهمية؛ حيث تُضاف عادةً إلى الأوساط مكملات خاصة تدعم بقاء الخلايا العصبية ونموها. وقد تشمل الإضافات الأخرى عقاقير تثبط انقسام الخلايا غير العصبية، مثل الخلايا الدبقية.

بعد خلط معلق الخلايا العصبية مع الوسط، تصبح الخلايا جاهزة للزراعة في الأوعية المطلوبة. ويمكن أن تشمل هذه الأوعية أطباق وأقراص الاستزراع أو شرائح زجاجية غطائية توضع داخل هذه الأوعية. وبما أن الخلايا العصبية لا يمكنها النمو مباشرة على الزجاج، يتم معالجة الشرائح الزجاجية مسبقًا لتهيئة أسطح أفضل لالتصاق الخلايا ونموها. ويمكن أن تشمل هذه المعالجات التغطية ببروتينات المصفوفة خارج الخلوية الاصطناعية، مثل poly-lysine وlaminin، أو النقش الحمضي لتخشين السطح.

بمجرد زراعتها، تُنمى الخلايا العصبية داخل حاضنة دافئة ورطبة. ويمكن ملاحظة نمو الاستطالات العصبية خلال ساعات إلى أيام. وللحفاظ على المستزرعات، يتم استبدال جزء من وسط الاستزراع بوسط جديد مرة واحدة أسبوعيًا تقريبًا. وعادةً ما تُستخدم مستزرعات الخلايا العصبية الأولية في التجارب في أي وقت يتراوح من بضعة أيام إلى بضعة أسابيع بعد الزراعة.

بعد أن أصبح لديك عصبونات تنمو في المزارع الخلوية، ماذا يمكنك أن تفعل بهذه الخلايا؟

تعد المعالجة الجينية عن طريق عفن الخلية (transfection) أو التنقيح الفيروسي (viral transduction) إحدى الطرق الأساسية الشائعة المطبقة على المزارع العصبونية. حيث يمكن إدخال مادة جينية تشفر، على سبيل المثال، بروتيناً طافراً إلى العصبونات المستزرعة لتعديل الوظيفة العصبونية. وبدلاً من ذلك، يمثل العفن الخلوي باستخدام RNA مزدوج السلسلة تقنية فعالة لمنع التعبير البروتيني. إن توفر طرق وكواشف متعددة للمعالجة الجينية يجعل هذا التطبيق ذا قيمة خاصة لمجموعة واسعة من الأسئلة البحثية.

من الأمثلة على الأسئلة التي يمكن الإجابة عليها باستخدام العفن الخلوي في المزارع العصبونية: كيف وأين يتم نقل بروتينات أو معقدات بروتينية معينة إلى الهياكل المورفولوجية المختلفة للعصبون؟ وللوصول إلى الإجابة، يتم إجراء عفن خلوي للعصبونات باستخدام DNA يشفر البروتين المستهدف، والذي يمكن دمجه مع بروتين فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر أو GFP. ومن ثم يمكن مراقبة أنماط الحركة وتمركز البروتين المسمى فلورياً باستخدام التصوير الحي. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة نقل مستقبلات النواقل العصبية إلى سطح الخلية، على سبيل المثال.

كما تعد المزارع العصبونية الأولية مفيدة جداً لدراسات الفسيولوجيا الكهربائية، حيث يمكن قياس النشاط الكهربائي للخلايا المفردة باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة. وتعني الطبقة الواحدة من العصبونات في المزرعة سهولة استهداف الخلايا الفردية، كما يتم تطبيق المعالجات، مثل العلاجات الدوائية، بسرعة وبشكل متساوٍ. فعلى سبيل المثال، يمكن قياس تأثير مركب اختباري على نشاط عصبون واحد باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) في العصبونات المستزرعة.

لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول المزارع العصبية الأولية. وقد استعرضنا في هذا الفيديو كيفية تحضير هذه المزارع وأنواع التجارب التي تُستخدم فيها عادةً. يمكن إنشاء المزارع العصبية الأولية من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة، وعادةً ما يتم ذلك باستخدام طريقة تتضمن التشريح، والتفكيك إلى معلق خلوي، والنمو في أوساط زرع داخل الحضانات.

شكرًا للمشاهدة!

غالباً ما تفرض تعقيدات الدماغ على علماء الأعصاب استخدام نظام أبسط لإجراء التلاعبات والملاحظات التجريبية. ومن النهج القوية في هذا الصدد توليد مستنبت أو…