Name: تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: اكتشف طريقة سريعة لتحليل التغيرات في شكل الخلايا وتوطين البروتينات في الخلايا التائية المستقطبة بواسطة الكيموكينات باستخدام تقنية تصوير التدفق الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب يعترف كثيرا بيير Bourdoncle، توماس غيلبير ولويز Rimbault مرفق كوشين التصوير. وأيد هذا العمل من قبل INSERM، CNRS والدوري الفرنسي الوطني مناهضة جنيه السرطان (إيكيب labellisée).

1. إعداد الخلايا اللمفاوية T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الماوس الأساسي أو خلايا T الإنسان كما هو موضح 10،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا T الإنسان في كامل المتوسطة RPMI مع المصل البشري 10٪ AB في مناطق ذات كثافة من 2-3 × 10 6 خلية / مل. ملاحظة: استخدام مصل الجنين العجل (FCS) بدلا من المصل البشري يمكن أن تثير الاستقطاب عفوية لجزء كبير من الخلايا T الإنسان في الثقافة. تبقى هذه الخلايا في الثقافة لمدة 4 - 5 ايام وعملية أخرى لهم في أي وقت خلال هذه الفترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا فأر T في كامل المتوسطة RPMI تستكمل مع 10٪ FCS في مناطق ذات كثافة خلية مماثلة. استخدام على الفور أو في اليوم التالي، وبعد O / N الثقافة عند 37 درجة مئوية في ظل وجود 10 نانوغرام / مل IL7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة T خط الخلية CEM الإنسان في استكمال كامل RPMI مع 10٪ FCS. </li></ol> 2. تحفيز Chemokine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 5 × 10 5 خلايا لكل حالة تجريبية في المتوسط ​​الدافئة HBSS تستكمل مع 10 ملي Hepeالصورة. وبالنسبة لبعض التجارب، وشارك في بالنقل خلايا T الإنسان الأساسي في اليوم السابق مع 2 ميكروغرام pmaxGFP و 8 ميكروغرام pcDNA3.1 + (ناقلات الفارغة، والسيطرة)، PKCζ كيناز الميتة، أو البلازميدات Par6 N-الطرفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في المتوسط ​​الدافئة HBSS-HEPES (استخدام 0.3 مل × عدد الظروف التجريبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع الخلايا في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. ملاحظة: ولذلك، فإن أنبوب واحد المقابلة لحالة تجريبية واحدة تحتوي على 5 × 10 5 الخلايا في 0.3 مل HBSS-HEPES المتوسطة. وبالنسبة لبعض التجارب، وإضافة 500 نانومتر Latrunculin A أو السيارة (DMSO)، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل التحفيز chemokine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10-500 نانوغرام / مل CCL19 أو CXCL12 chemokine في كل أنبوب. ملاحظة: نحن عادة استخدام 10-200 نانوغرام chemokine مل / للخلايا T الإنسان. خلايا CEM لا تعبر عن مستقبلات CCR7 التي تربط CCL19. ولذلك، فإن خلايا CEM تكون قادرة على الاستجابة لتحفيز CXCL12 فقط. وعلاوة على ذلك، استخدام تركيزات أعلى chemokine (300-500 نز / مل) إلى استقطاب خلايا فأر T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الأنابيب عدة مرات، واحتضان لهم في 37 ° C حمام الماء لمدة 8 أو 10 دقيقة للخلايا T الابتدائية أو CEM، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف عملية الاستقطاب عن طريق إضافة إلى كل أنبوب 0.3 مل من محلول دافئ يحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) و10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. الوجه الأنابيب واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li></ol> 3. Stainings <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا من أنابيب microcentrifuge في التدفق الخلوي الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنابيب تماما مع حل RT تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 460 x ج لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من حل RT تحتوي على 5٪ FCS في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من FITC المضادة للHLA-ABC في كل أنبوب، دوامة لهم، واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT، بعيدا عن الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ FCS، وهوND مرة واحدة مع PBS فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في RT: إضافة 500 ميكرولتر 1٪ PFA، واحتضان لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل الخلايا مع محلول يحتوي على 1٪ BSA، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، وملء أنابيب تماما بمحلول PBS تحتوي على 0.2٪ BSA، 0.1٪ سابونين، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES (العازلة permeabilization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين في هذه الوسيلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الأنابيب لإزالة المتوسطة ودوامة لهم لفصل بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.25 ميكروغرام / مل TRITC-Phalloidin و / أو 1: 100 التخفيف من مكافحة P-ERM الأجسام المضادة لكل أنبوب، دوامة لهم واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع المخزن المؤقت permeabilization. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر PBS ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge. ملاحظة: خلايا جاهزة للشراء. بدلا من ذلك، مع الحفاظ على حجم الحد الأقصى لمجموع 200 ميكرولتر في الأنبوب، إضافة المركزة PFA إلى النهائي 1٪تركيز من أجل الحفاظ على stainings إذا لم يتم استخدام خلايا في نفس اليوم لمزيد من المعالجة. </li></ol> 4. الصور اقتناء وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على جهاز (انظر الجدول من الكواشف محددة / المعدات) والسماح لها معايرة نفسه وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: تم استخدام البرنامج INSPIRE مع الهدف 40X (0.75 NA). تم استخدام IDEAS 3.0 برامج لجميع quantifications المبلغ عنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة من النوافذ الاستحواذ والتي يمكن حفظها في قالب للتجارب المستقبلية. رسم رسوم بيانية أن تحديد القيم التدرج RMS. من &quot;تحت المجهر&quot; السكان، واختيارهم على الرسم البياني RMS التدرج، delimitate &quot;خلية واحدة&quot; السكان على الرسم البياني للمنطقة. مرة واحدة وقد تم إدخال أنبوب microcentrifuge في الجهاز، وضبط قوة الليزر، بوابة على الخلايا الفردية واكتساب 5،000 اللمفاويات التائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الأفكار الناعمةوير، فتح ملف اقتناء وإنشاء الرسم البياني التي سوف تظهر قيمة قيمة RMS التدرج للصور المجال مشرق (القناة 1) التي تم الحصول عليها لكل خلية على حدة. رسم بوابة على الرسم البياني التدرج RMS التي تعتبر الخلايا العارضة RMS قيمة التدرج فوق 57. ملاحظة: التدرج RMS يسمح مع الأخذ بعين الاعتبار في التحليل فقط الخلايا الليمفاوية T التي هي في المستوى البؤري. لقد تحدد تجريبيا أن الخلايا الفردية واظهار قيمة التدرج RMS متفوقة على 57 هي في المستوى البؤري، ويمكن اعتبارها بشكل دقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في / القائمة أقنعة تحليل، وخلق قناع جديد، ودعا تآكل (M01،2) من قناع التشكل على الصور brightfield M01، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة للمنطقة، وتحسب على تآكل (M01،2) قناع. من الخلايا المحددة في البوابة السابقة، فتح الرسم البياني يبين مجال الخلايا باستخدام هذا القناع تم إنشاؤه حديثا. أقنعة والتشكل التي تتوفر حسب: ملاحظةالافتراضية هي أكبر بكثير من الحجم الفعلي للخلية. وبالتالي، فمن أكثر دقة لتآكل ليصل إلى 2 بكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم بوابة على خلايا T الفردية، باستثناء الخرز المعايرة والحطام (المنطقة الصغيرة) والحلل (المنطقة الكبيرة). ضبط هذه البوابة في كل الاستحواذ. ملاحظة: سوف الاختلافات في حجم الخلية يؤثر على موقف البوابة. كما خلايا فأر T هي أصغر من خلايا T الإنسان التي هي نفسها أصغر من خلايا CEM، فإن مساحة كل نوع من الخلايا تكون متناسبة مع حجمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النظر في واحدة، في تركيز الخلايا التي تم بوابات في الخطوات السابقة، فتح مؤامرة نقطة تتكون من الخام ماكس بكسل على تلطيخ HLA-ABC (القناة 2، محور س) بوصفها وظيفة من الخام ماكس بكسل على phalloidin تلطيخ (قناة 4، محور Y). إنشاء بوابة لاستبعاد الأحداث فلوري غير ملوثين أو المشبعة. فتح اثنين من رسوم بيانية تبين الخام ماكس بكسل لHLA-ABC (قناة 2) وphalloidin (قناة 4) stainings. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تحليل / القائمة أقنعة، يخلقعصام قناع جديد، ودعا تآكل (M02،2) من قناع مورفولوجيا الخلايا HLA-ABC الملون (قناة 2)، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة تتألف من المعلمة الاستدارة، وتحسب على تآكل (M02،2). ملاحظة: يقيس هذا المعامل انحراف شكل خلية من دائرة. ولذلك، فإن خلية T مستديرة تماما يكون لها قيمة عالية دائرية في حين أن الخلايا الاستقطاب ممدود سوف يحمل الرقم القياسي دائرية منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي وقت لاحق، وخلق الرسم البياني آخر من شأنه أن يقدم تقريرا قيم ميزة الاستدارة من الخلايا المغلقة سابقا. استخدام هذا الرسم البياني لرسم مباشرة توزيع الفرد والسكان خلية في التركيز وفقا لقيمة الاستدارة لكل خلية على حدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعند النظر إلى شكل الرسم البياني للخلايا غير حفز، رسم بوابة للخلايا الاستقطاب، ابتداء من الساعة قيمة أدنى دائرية يصل إلى قيمة الحد دائرية، حيث ان معظم الخلايا غير حفزيتم رسم. نظرة على عرض إحصاءات عن النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب بين السكان بوابات (٪ بوابات). ملاحظة: لقد حددت هذه البوابة للقيم مؤشر الاستدارة أقل من 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل أن ننظر إلى الاستقطاب من تلطيخ الأكتين في الخلايا، رسم بياني لتفاصيل مشرق قيمة التشابه R3، مقارنة تلطيخ HLA-ABC (قناة 2) وتلطيخ phalloidin (قناة 4). ملاحظة: أكبر قيمة من هذه الميزة، وأكثر فرضه stainings هما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام استراتيجية النابضة نفسها كما كان من قبل، رسم بوابة على الخلايا غير حفز لتلطيخ فصل يبين النسبة المئوية للخلايا مع المستقطب الأكتين تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء، وتظهر النسبة المئوية للخلايا واظهار الفصل في توزيع الدرجة الأولى MHC وstainings phalloidin، النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب جنبا إلى جنب مع القيم المتوسطة من الاستدارة والتشابه مؤشرات جميع خلايا ± SD في الموافقوحات إحصاءات onding. </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

باستخدام تقنية حديثة من تدفق التصوير الخلوي، ووضع استراتيجية النابضة سريعة ومفيدة لتحليل الأحداث الخلوية والجزيئية الناجم عن التحفيز chemokine يرد. من تجربة واحدة، يمكن للمرء الحصول على نوعين رئيسيين من المعلومات: التغييرات في مورفولوجية الخلايا الناجم عن التحفيز chemokine وتوزيع التحت خلوية من البروتينات المختلفة أثناء عملية الاستقطاب. ومن المثير للاهتمام، وتقدم الأدلة أيضا على إمكانية تحليل عدد كبير من الخلايا، والذي يسمح متانة الإحصائية والتحليلات ذات الصلة لجزء صغير من السكان ...

كيموكينات هي بروتينات قابلة للذوبان الصغيرة التي تجذب الخلايا لمواقع متخصصة 1. ولذلك، فإنها تشارك في الموضع الصحيح من الخلايا في الأنسجة، وهي وظيفة حاسمة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء. الجهاز المناعي ليست استثناء لهذه القاعدة لأنها تعتمد على عمل العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تعمل في تناسق لجبل استجابة مناعية فعالة. من خلال التحكم في موقع معين من نوع واحد الخلايا المناعية في حالة معينة، كيموكينات هي المطلوبة مسبقا قبل أن يتم الكشف عن المستضدات الأجنبية وتحييدها. في الخلايا الليمفاوية T على وجه الخصوص، كيموكينات تربط لمستقبلات محددة السطح والتي، على المشاركة، وانتزاع العديد من الإشارات بين الخلايا (ارتفاع الكالسيوم، ERK الفسفرة، وتفعيل رو GTPases، وزيادة في integrins تقارب وهيكل الخلية التعديلات) التي تفضل T خلية حركية 2،3. على المستوى الخلوي، ويمكن للمرء أن يلاحظ التغيرات المورفولوجية أثار chemokine على التحفيز.هذه التغيرات في الأشكال خلية مثيرة خصوصا في خلايا T: يستريح خلايا T لها مورفولوجيا مستديرة تشبه حبة عند السفر في مجرى الدم. ومع ذلك، فإن الاستشعار عن وجود كيموكينات في مواقع التهابات أو على القرب من الأجهزة اللمفاوية هو الذهاب الى تغيير شكل خلايا T التي تعتمد الآن على &quot;اليد مرآة&quot; مورفولوجيا نموذجية تتكون من شكل ثنائي القطب: حافة الرائدة في الجبهة وميزة زائدة، أو قدم ذنبية، في الجزء الخلفي 4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمكونات داخل الخلايا تفصل في هذه المناطق المعاكس اثنين من خلية T المستقطبة للحفاظ على الهجرة. على سبيل المثال، ويزيد من خيوط الأكتين البلمرة على chemokine التحفيز 5 و الأكتين بلمرة تتراكم في الجزء الأمامي من T خلية الاستقطاب 2. من ناحية أخرى، والعديد من البروتينات، مثل البروتينات فسفرته من Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) الأسرة التي تربط بين غشاء البلازما إلى القشرية الهيكل الخلوي F-الأكتين، وإعادة توطين في قدم ذنبية من الاستقطابخلايا T 6. ومن المثير للاهتمام، نحن وغيرنا قد أظهرت أن هناك حاجة لهذه العملية الاستقطاب T الهجرة الخلية. والواقع أن أي علاج الذي يتداخل مع الاستقطاب تمنع الحركة الخلوية. على سبيل المثال، وتثبيط لنشاط أعضاء من البروتين غير نمطية تحركات C (PKC) أسرة، وكتل PKCζ وPKCι T الاستقطاب الخلية ولها عملية المسح المهاجرة من الخلايا الجذعية 7. وينظم T خلية الاستقطاب أيضا رو GTPases. لقد أظهرنا أن تعديل النشاط RhoA من البروتين Fam65b وصف مؤخرا يتداخل مع التغيرات الخلايا التائية في التشكل وقدرتها على الهجرة في مقايسة Transwell 6. كما الاستقطاب هو خطوة شرط أساسي لحركية الخلوية، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد بأنها قراءات الرئيسية من الردود chemokine. تم إجراء تعديلات شكل خلية قياس سابقا يدويا 8. ومع ذلك، هذا النوع من القياس الكمي هو جدا تستغرق وقتا طويلا، بحيث عادة سوى عدد قليلتؤخذ عشرات الخلايا في الاعتبار. هنا، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس بسرعة درجة التعديلات شكل من الخلايا الليمفاوية T تتعرض لchemokine التحفيز. تدفق التصوير الخلوي التكنولوجيا (انظر الجدول من الكواشف محددة / معدات) يستخدم، والذي يجمع بين مزايا تدفق عداد الكريات والمجهر 9 لقياس كفاءة كمية من الخلايا الاستقطاب في ظروف مختلفة من التحفيز chemokine. بالإضافة إلى تقدير حجم التعديلات الشكلية التي يمكن للمرء أن قياس بقوة مع هذه التكنولوجيا، فمن الممكن أيضا لتقييم التغيرات في توطين التحت خلوية من بعض البروتينات على chemokine الإشارات.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>مصل بشري AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>تسخين مسبق لتعطيل المكمل.</td></tr><tr><td>مصل ربلة الساق الجنينية</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>تسخين مسبق لتعطيل المكملة.</td></tr><tr><td>مجموعة العوامل النووية للخلايا التائية البشرية</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام.</td></tr>يتم إذابة <tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots على الجليد قبل إضافة الكيموكين إلى الخلايا.</td></tr>يتم <tr>إذابة Aliquots <td>البشرية CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>على الجليد قبل إضافة الكيموكين إلى الخلايا.</td></tr>يتم <tr>إذابة <td>CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots البشرية على الجليد قبل إضافة الكيموكين إلى الخلايا. يمكن أيضا استخدام هذا الكيموكين على الخلايا التائية للفأر.</td></tr><tr><td>علوم المجهر الإلكتروني</td> <td>PFA</td><td>157-8-100</td><td>هذا محلول 8٪ PFA في الماء. امزج الحجم إلى الحجم باستخدام 2x PBS للحصول على محلول PFA بنسبة 4٪ في PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC الجسم المضاد</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>استنساخ B9.12.1</td></tr><tr>تقنية <td>إشارات خلايا</td><td>الأجسام المضادة المضادة</td><td>ل P-ERM 3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>أمنس</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة chemokine اشارة

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

خلايا تستجيب لchemokine التحفيز عن طريق فقدان شكلها جولة في عملية تسمى الاستقطاب، وعن طريق تغيير توطين التحت خلوية من العديد من البروتينات. وقد استخدمت تقنيات التصوير الكلاسيكية لدراسة هذه الظواهر. ومع ذلك، أنها تتطلب اكتساب اليدوي من العديد من الخلايا تليها تستغرق وقتا طويلا الكمي من التشكل وشارك في توطين تلطيخ عشرات الخلايا. هنا، يتم وصف طريقة سريعة وقوية لدراسة هذه الظواهر على عينات تتكون من عدة آلاف من الخلايا باستخدام التدفق الخلوي التصوير التكنولوجيا التي تجمع بين مزايا المجهر مع تلك من عداد الكريات. استخدام الخلايا الليمفاوية T حفز مع CCL19 وتلطيخ لجزيئات MHC من الدرجة الأولى والأكتين الخيطية، وتقدم استراتيجية النابضة لقياس في وقت واحد درجة التعديلات شكل ومدى التعاون توطين علامات التي تتأثر CCL19 الإشارات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الاستراتيجية النابضة سمحت لنا observه الفصل بين الأكتين الخيطية (في الجبهة) وفسفرته Ezrin-Radixin-Moesin (الفوسفات-ERM) البروتينات (في العمق) في خلايا T الاستقطاب بعد التحفيز CXCL12. وكانت هذه التقنية مفيدة لمراقبة تأثير حظر على الاستقطاب من عنصرين مختلفين أيضا: تثبيط الأكتين البلمرة التي كتبها مثبط الدوائية والتعبير عن المسوخ من Par6 / شاذة PKC يشير المسار. وهكذا، يظهر دليل على أن هذه التقنية مفيدة لتحليل كل التعديلات الشكلية وإعادة التوزيع البروتين.

المثال الأول المختار هنا يتعلق باستخدام الخلايا الليمفاوية T الأساسي الإنسان حفز مع CCL19. ومع ذلك، فإن الاستراتيجية ذاتها يمكن استخدامها مع خلايا T الماوس الابتدائي، خطوط الخلايا T أو أي نوع من الخلايا الأخرى استجابة لتحفيز chemokine. استراتيجية النابضة المعروضة هنا تشمل سلسلة من نوافذ يمكن تحديد أحداث مركزة، ثم الخلايا واحدة. وأخيرا تم اتباع مجموعة من كثافة مضان هنا كمثال على اثنين من علامات: وMHC من الدرجة الأولى HLA-ABC والأكتين الخيطية ليستريح (الشكل 1) أو حف...

تثير إشارات الكيموكين تغييرات ملحوظة في التشكل الخلوي وبعض عمليات إعادة التوزيع المهمة للبروتينات داخل الخلايا. هنا ، يتم توفير بروتوكول سريع ومفصل لدراسة هذه الأحداث.

تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

الهدف من الإجراء التالي هو تحديد التغيرات في مورفولوجيا الخلية بسرعة وتلقائيا والتوطين الخلوي لبروتينات معينة ذات أهمية في أعداد كبيرة من الخلايا استجابة لمحفز معين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحفيز الخلايا التائية أولا مع أنواع العلاج الكيميائي الفائدة. في الخطوة الثانية ، يتم تصنيف الخلايا بالفلورسنت ثم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للتصوير.في الخطوة الأخيرة ، يمكن تقييم عدد الخلايا الليمفاوية المستقطبة شكليا ومقدار فصل علامات الفلورسنت بناء على الموقع وشدة وحدات البكسل لكل تلطيخ ، اعتمادا على القناع المختار. في النهاية ، يمكن استخدام تقنية قياس تدفق التصوير هذه لتحديد التغيرات المورفولوجية للخلايا الليمفاوية بعد تحفيز الكيموكينات بسرعة وقوة ، بالإضافة إلى موقع بروتينات معينة ذات أهمية داخل الخلايا المستقطبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري هي أنه يمكن معالجة عدد كبير من الخلايا بشكل متكرر وتحليلها تلقائيا ، مما يضمن تحليلا قويا إحصائيا للتغيرات المورفولوجية وتوزيع البروتين.في الخلايا الليمفاوية التائية المحفزة بالكيموكين ، يبدأ التحفيز اللطيف للخلايا التائية من Boche بغسل الخلايا الخمس في كل حالة تجريبية في HBSS الدافئ المكملة بجهاز طرد مركزي HEPs 10 ملليمولار لمدة خمس دقائق عند 340 مرة G.At درجة حرارة الغرفة ، وإزالة supinate وإعادة تعليق الكريات في 0.3 مل من HBSS الدافئ الذي قطعه في أنبوب. ثم انقل معلقات الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 ملليلتر. أضف 10 إلى 500 نانوجرام لكل مليلتر من الكيموكين إلى كل أنبوب ، ثم اقلب الأنابيب عدة مرات للخلط.احتضان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد ثماني إلى 10 دقائق ، أوقف الاستقطاب باستخدام 0.3 مل من البارالديهايد الدافئ بنسبة 2٪ مع 10 ملليمول. هو البازلاء.ثم امزج الأنابيب بمزيد من التقليب واحتضانها لمدة خمس دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية لتلطيخ الخلايا لتحليل التألق المناعي. بعد ذلك ، انقل الخلايا التائية المحفزة إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المقابلة. املأ الأنابيب بالكامل بمخزن مؤقت للتلطيخ.ثم قم بتدوير الخلايا وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 5٪ في PBS. أضف الآن خمسة ميكرولترات من ZI N-T-H-L-A-A-B-C إلى كل أنبوب. دوامة لهم واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة من درجة حرارة الغرفة في الظلام في نهاية الحضانة.اغسل الخلايا مرتين ثم احتضانها في 500 ميكرولتر من 1٪ بارا فورمالديهايد. بعد 10 دقائق ، اغسل الخلايا في مخزن مؤقت أكثر تلطيخا ، ثم املأ الأنابيب بالكامل بمخزن مؤقت للنفاذ. بعد غسل الخلايا مرتين في المخزن المؤقت للنفاذية ، تركت الأنابيب لإزالة السوبينات ثم قم بدوامها لفصل كريات الخلية.الآن تلطيخ العينات بنقطة صفر 25 ميكروغرام لكل مليلتر ، تريكسي للخاصرة ، دوامة لها واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم في نهاية فترة الحضانة ، اغسل الخلايا في عازلة النفاذ. مرة أخرى ، resus.قم بتعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS ثم انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية لتحديد النسبة المئوية للخلايا التائية المستقطبة بعد تحفيز الكيموكين. قم أولا بتشغيل مقياس تدفق التصوير الخلوي واتركه يمعايرة نفسه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ارسم الرسوم البيانية التي تحدد قيم تدرج RMS من السكان في التركيز البؤري المحدد على تدرج RMS.يحدد الرسم البياني عدد الخلايا المفردة على الرسم البياني للمنطقة بمجرد إدخال أنبوب الطرد المركزي الصغير في الجهاز ، وضبط مشية طاقة الليزر على الخلايا الفردية والحصول على 5 ، 000 الخلايا الليمفاوية T. في برنامج تحليل الأفكار. افتح الملفات المكتسبة ، ثم قم بإنشاء رسم بياني يوضح قيمة RMS المتدرجة لصور المجال الساطع التي تم الحصول عليها لكل خلية على حدة ، ورسم بوابة على الخلايا ، وإظهار قيمة تدرج RMS أعلى من 57.في قائمة التحليل ، قم بإنشاء قناع جديد يسمى تآكل M1 اثنين من قناع التشكل على صور المجال الساطع M صفر واحد تآكل من بكسلين. ثم في قائمة ميزات التحليل ، قم بإنشاء ميزة جديدة للمنطقة المحسوبة على تآكل قناع M1 اثنين من الخلايا التي تم إنشاؤها في البوابة السابقة. افتح رسما بيانيا يوضح مساحة الخلايا باستخدام هذا القناع الذي تم إنشاؤه حديثا ، ارسم بوابة على الخلايا التائية الفردية ، باستثناء حبات المعايرة والحطام في المنطقة الصغيرة ، بالإضافة إلى الزوجيات في المنطقة الكبيرة.ثم افتح أ. روبوت يتكون من الحد الأقصى الخام على تلطيخ H-L-A-A-B-C كدالة للبكسل الخام الأقصى على تلطيخ Phin في قائمة أقنعة التحليل من الخلف إلى قناع جديد يسمى erode M اثنان من قناع التشكل لخلايا بقع H-L-A-A-B-C المتآكلة من بكسلين. ثم في قائمة ميزات التحليل ، قم بإنشاء ميزة جديدة تتكون من معلمة التدوير المحسوبة على تآكل M اثنين.بعد ذلك ، قم بإنشاء رسم بياني آخر للإبلاغ عن قيم ميزة التدوير من الخلايا المسورة مسبقا. ثم بالنظر إلى شكل الرسم البياني للخلايا غير المحفزة ، عقيق التناضح العكسي للخلايا المستقطبة ، بدءا من أدنى قيمة دائرية حتى قيمة حد الدائرية حيث يتم رسم معظم الخلايا غير المحفزة لتقييم استقطاب تلطيخ الأكتين داخل الخلايا. بالإضافة إلى رسم بياني لتشابه التفاصيل الساطعة ، R ثلاث قيمة لمقارنة H-L-A-A-B-C و foid في التلوين.ثم استخدام نفس استراتيجية البوابات كما هو موضح للتو ، بالإضافة إلى GA على الخلايا غير المحفزة للتلوين المنفصل غير الموضعي المشترك. توضح لوحة الإحصائيات النسبة المئوية للخلايا التائية ذات تلطيخ الأكتين المستقطب هنا. يتم عرض أمثلة على الخلايا الليمفاوية التائية المحفزة CCL 19 التي تقع في بوابة الخلايا غير المستقطبة أو المستقطبة.يمكن ملاحظة الاختلافات في التشكل بين كلا المجموعتين الفرعيتين بوضوح. يمكن أيضا استخدام استراتيجية البوابات التي تم إوضاؤها للتو لرسم النسبة المئوية للخلايا التي تقع في البوابة المستقطبة في حالة عدم وجود CCL 19. كما هو متوقع ، من الواضح أن تحفيز الكيموكين يزيد من النسبة المئوية للخلايا التائية المستقطبة.يمكن أيضا رسم متوسط مؤشر التدوير لمجموعة الخلايا بأكملها التي تم الحصول عليها في كلتا الحالتين. في الواقع ، يؤدي تحفيز CCL 19 إلى انخفاض في هذا المؤشر. ومع ذلك ، نظرا لأن نصف الخلايا فقط مستقطبة ، فإن التغيير في متوسط مؤشر الدائرية الذي لوحظ عند تحفيز CCL 19 صغير.في هذه التجربة ، تم تقطيع الخلايا التائية مع GFP مع بلازميدات ترميز الطفرات السلبية السائدة لمركب القطبية السادسة. PKC زيتا. سمح الرسم البياني للخلايا غير المنقولة ببوابة محددة للخلايا التائية الإيجابية GFP ذات الصلة مما يشير إلى أن جزءا صغيرا من مجموعة الخلايا بأكملها قد تم نقلها.ثم تم قياس درجة الاستقطاب المورفولوجي لهذه الخلايا المنقولة عن طريق قياس مؤشر الدائرية للخلايا الإيجابية GFP فقط ومشية إضافية للخلايا التائية. تم إنشاء إظهار قيم منخفضة من الدائرية لتقدير النسبة المئوية للخلايا المستقطبة في ظل كل حالة مأخوذة. توضح هذه البيانات معا أن تعطيل وظيفة مسار الإشارات PK CZ على قدم المساواة ستة يثبط استقطاب الخلايا التائية الناجم عن كل من الكيموكينات CCL 19 و c Xcl 12.تمشيا مع النتائج السابقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا العمل دائما عند 37 درجة مئوية طوال خطوة تحفيز الأقارب والتثبيت التالي لضمان استقطاب مورفولوجي قوي وموثوق للخلايا الليمفاوية.

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

هنا ، نحن تصف تفصيلا التصوير الخلية الحية أساليب التحقيق الكيميائي. نقدم أساليب مضان المجهري لرصد ديناميات spatiotemporal من الأحداث يشير في الخلايا المهاجرة. قياس الأحداث يشير يسمح لنا أن نفهم كذلك كيف شبكة النوع من الاختزال ، يشير يحقق التدرج الاستشعار من chemoattractants وضوابط الهجرة الاتجاه من الخلايا حقيقية النواة.

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

يوضح هذا الفيديو مقايسة الانجذاب الكيميائي للعدلات باستخدام طريقة الكل على الرقاقة. تسمح الطريقة بالعزل المباشر للعدلات من الدم الكامل عن طريق الانتقاء السلبي المغناطيسي المناعي متبوعا بفحص الانجذاب الكيميائي على شريحة ميكروفلويديك.

طريقة قائمة على رقاقة الموائع الدقيقة لتحليل الانجذاب الكيميائي للعدلات السريع باستخدام الدم الكامل

يتم تقديم طريقة لاكتساب رؤى جديدة حول تعقيد الاستجابة الالتهابية للدماغ. نصف البروتوكولات القائمة على التألق المناعي متبوعة بتحليل متحد البؤر ثلاثي الأبعاد للتحقيق في نمط التعبير المشترك لعلامات النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعم في نموذج فأر لنقص التروية البؤري.

التحليل متحد البؤر ثلاثي الأبعاد لعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعم للاستقطاب في إصابات الدماغ التجريبية

على المستوى تحت الخلوي ، يتم تعديل أحداث الإشارات ديناميكيا بواسطة الإشارات التنموية والبيئية. نصف هنا بروتوكولا يستخدم نظام التعبير العابر للتبغ لمراقبة التفاعل الديناميكي بين البروتين والبروتين والكشف عن التنظيم المكاني لنقل الإشارة في الخلايا النباتية.

التصوير إعادة التنظيم المكاني لMAPK اشارة المسار باستخدام نظام التعبير عابر التبغ

المقايسات الكيميائي البصرية ضرورية لفهم أفضل لكيفية الخلايا حقيقية النواة التحكم بوساطة جاذب كيميائي الاتجاه الهجرة الخلية. هنا، نحن تصف الأساليب التفصيلية ل: 1) في الوقت الحقيقي، وارتفاع القرار، رصد المقايسات الكيميائي متعددة، و2) تصور في وقت واحد التدرج جاذب كيميائي وديناميات الزمانية المكانية من الإشارات الأحداث في الخلايا HL60 مثل العدلات.

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

توفر هذه المقالة طريقة مفصلة لإجراء فحص الكيميائي العدلة السريع عن طريق دمج العزلة على رقاقة العدلات من الدم الكامل واختبار الكيميائي على رقاقة ميكروفلويديك واحدة.

طريقة الكل على رقاقة للتحليل الكيميائي العدلات السريعة مباشرة من قطرة الدم

بروتوكولات للتقييم الكمي اللمفاويات إنزيمية والهجرة أدوات هامة لبحوث علم المناعة. ويرد هنا، بروتوكولا في المختبر أن التصاريح في الوقت الحقيقي، متعدد التقييم للهجرة الخلية، وكذلك تكميلية في فيفو تقنية تمكينية تتبع الخلايا الأصلية للطحال.

التحديد الكمي الوحيدات البشرية إنزيمية في المختبر واللمفاويات مورين الاتجار في فيفو

هنا يصف لنا أساليب لتقييم الاستجابة الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحادة. في التحليل القائم على الفحص المجهري، ندرس تعريب هذه الأجهزة بعد التحفيز مختصرة مع تدفق القص المسمى فلوريسسينتلي. ونحن أيضا اختبار تنشيط البروتينات المختلفة لمصلحة في الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة المتحلل.

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

نقدم بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين الضامة البشرية وتطبيق هذا على تحديد أثر بيئة منخفضة الأكسجين في الاستقطاب بلعم.

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

نحن وصف طريقه لبناء الاجهزه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والهيكل العضوي متعدد الخلية. يسمح هذا الجهاز بتحليل الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان في البيئات المجهرية ثلاثية الابعاد مع تدرجات تشيمواتراكتانت محدده. Organoids هي أفضل من خلايا واحده في الكشف عن المدخلات الضعيفة الصاخبة.

تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت

لاختبار تأثير chemokine على تجنيد الضامة في الجسم الحي، تم استخدام جبل كامل في الموقع التهجين للكشف عن التعبير خارج الرحم من chemokine، واستخدمت تلطيخ المناعة لتسمية الضامة. تم استخدام التصوير الحي للمراقبة في الوقت الحقيقي لهجرة الضامة.

نموذج تعبير كيميائي خارج الرحم لاختبار توظيف الضامة في فيفو

اكتشف طريقة سريعة لتحليل التغيرات في شكل الخلايا وتوطين البروتينات في الخلايا التائية المستقطبة بواسطة الكيموكينات باستخدام تقنية تصوير التدفق الخلوي.

تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة

استكشف المزيد من الفيديوهات