تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة
ديسمبر 12, 2014
تثير إشارات الكيموكين تغييرات ملحوظة في التشكل الخلوي وبعض عمليات إعادة التوزيع المهمة للبروتينات داخل الخلايا. هنا ، يتم توفير بروتوكول سريع ومفصل لدراسة هذه الأحداث.
الهدف من الإجراء التالي هو تحديد التغيرات في مورفولوجيا الخلية بسرعة وتلقائيا والتوطين الخلوي لبروتينات معينة ذات أهمية في أعداد كبيرة من الخلايا استجابة لمحفز معين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحفيز الخلايا التائية أولا مع أنواع العلاج الكيميائي الفائدة. في الخطوة الثانية ، يتم تصنيف الخلايا بالفلورسنت ثم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للتصوير.
في الخطوة الأخيرة ، يمكن تقييم عدد الخلايا الليمفاوية المستقطبة شكليا ومقدار فصل علامات الفلورسنت بناء على الموقع وشدة وحدات البكسل لكل تلطيخ ، اعتمادا على القناع المختار. في النهاية ، يمكن استخدام تقنية قياس تدفق التصوير هذه لتحديد التغيرات المورفولوجية للخلايا الليمفاوية بعد تحفيز الكيموكينات بسرعة وقوة ، بالإضافة إلى موقع بروتينات معينة ذات أهمية داخل الخلايا المستقطبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري هي أنه يمكن معالجة عدد كبير من الخلايا بشكل متكرر وتحليلها تلقائيا ، مما يضمن تحليلا قويا إحصائيا للتغيرات المورفولوجية وتوزيع البروتين.
في الخلايا الليمفاوية التائية المحفزة بالكيموكين ، يبدأ التحفيز اللطيف للخلايا التائية من Boche بغسل الخلايا الخمس في كل حالة تجريبية في HBSS الدافئ المكملة بجهاز طرد مركزي HEPs 10 ملليمولار لمدة خمس دقائق عند 340 مرة G.At درجة حرارة الغرفة ، وإزالة supinate وإعادة تعليق الكريات في 0.3 مل من HBSS الدافئ الذي قطعه في أنبوب. ثم انقل معلقات الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 ملليلتر. أضف 10 إلى 500 نانوجرام لكل مليلتر من الكيموكين إلى كل أنبوب ، ثم اقلب الأنابيب عدة مرات للخلط.
احتضان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد ثماني إلى 10 دقائق ، أوقف الاستقطاب باستخدام 0.3 مل من البارالديهايد الدافئ بنسبة 2٪ مع 10 ملليمول. هو البازلاء.
ثم امزج الأنابيب بمزيد من التقليب واحتضانها لمدة خمس دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية لتلطيخ الخلايا لتحليل التألق المناعي. بعد ذلك ، انقل الخلايا التائية المحفزة إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المقابلة. املأ الأنابيب بالكامل بمخزن مؤقت للتلطيخ.
ثم قم بتدوير الخلايا وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 5٪ في PBS. أضف الآن خمسة ميكرولترات من ZI N-T-H-L-A-A-B-C إلى كل أنبوب. دوامة لهم واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة من درجة حرارة الغرفة في الظلام في نهاية الحضانة.
اغسل الخلايا مرتين ثم احتضانها في 500 ميكرولتر من 1٪ بارا فورمالديهايد. بعد 10 دقائق ، اغسل الخلايا في مخزن مؤقت أكثر تلطيخا ، ثم املأ الأنابيب بالكامل بمخزن مؤقت للنفاذ. بعد غسل الخلايا مرتين في المخزن المؤقت للنفاذية ، تركت الأنابيب لإزالة السوبينات ثم قم بدوامها لفصل كريات الخلية.
الآن تلطيخ العينات بنقطة صفر 25 ميكروغرام لكل مليلتر ، تريكسي للخاصرة ، دوامة لها واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم في نهاية فترة الحضانة ، اغسل الخلايا في عازلة النفاذ. مرة أخرى ، resus.
قم بتعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS ثم انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية لتحديد النسبة المئوية للخلايا التائية المستقطبة بعد تحفيز الكيموكين. قم أولا بتشغيل مقياس تدفق التصوير الخلوي واتركه يمعايرة نفسه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ارسم الرسوم البيانية التي تحدد قيم تدرج RMS من السكان في التركيز البؤري المحدد على تدرج RMS.
يحدد الرسم البياني عدد الخلايا المفردة على الرسم البياني للمنطقة بمجرد إدخال أنبوب الطرد المركزي الصغير في الجهاز ، وضبط مشية طاقة الليزر على الخلايا الفردية والحصول على 5 ، 000 الخلايا الليمفاوية T. في برنامج تحليل الأفكار. افتح الملفات المكتسبة ، ثم قم بإنشاء رسم بياني يوضح قيمة RMS المتدرجة لصور المجال الساطع التي تم الحصول عليها لكل خلية على حدة ، ورسم بوابة على الخلايا ، وإظهار قيمة تدرج RMS أعلى من 57.
في قائمة التحليل ، قم بإنشاء قناع جديد يسمى تآكل M1 اثنين من قناع التشكل على صور المجال الساطع M صفر واحد تآكل من بكسلين. ثم في قائمة ميزات التحليل ، قم بإنشاء ميزة جديدة للمنطقة المحسوبة على تآكل قناع M1 اثنين من الخلايا التي تم إنشاؤها في البوابة السابقة. افتح رسما بيانيا يوضح مساحة الخلايا باستخدام هذا القناع الذي تم إنشاؤه حديثا ، ارسم بوابة على الخلايا التائية الفردية ، باستثناء حبات المعايرة والحطام في المنطقة الصغيرة ، بالإضافة إلى الزوجيات في المنطقة الكبيرة.
ثم افتح أ. روبوت يتكون من الحد الأقصى الخام على تلطيخ H-L-A-A-B-C كدالة للبكسل الخام الأقصى على تلطيخ Phin في قائمة أقنعة التحليل من الخلف إلى قناع جديد يسمى erode M اثنان من قناع التشكل لخلايا بقع H-L-A-A-B-C المتآكلة من بكسلين. ثم في قائمة ميزات التحليل ، قم بإنشاء ميزة جديدة تتكون من معلمة التدوير المحسوبة على تآكل M اثنين.
بعد ذلك ، قم بإنشاء رسم بياني آخر للإبلاغ عن قيم ميزة التدوير من الخلايا المسورة مسبقا. ثم بالنظر إلى شكل الرسم البياني للخلايا غير المحفزة ، عقيق التناضح العكسي للخلايا المستقطبة ، بدءا من أدنى قيمة دائرية حتى قيمة حد الدائرية حيث يتم رسم معظم الخلايا غير المحفزة لتقييم استقطاب تلطيخ الأكتين داخل الخلايا. بالإضافة إلى رسم بياني لتشابه التفاصيل الساطعة ، R ثلاث قيمة لمقارنة H-L-A-A-B-C و foid في التلوين.
ثم استخدام نفس استراتيجية البوابات كما هو موضح للتو ، بالإضافة إلى GA على الخلايا غير المحفزة للتلوين المنفصل غير الموضعي المشترك. توضح لوحة الإحصائيات النسبة المئوية للخلايا التائية ذات تلطيخ الأكتين المستقطب هنا. يتم عرض أمثلة على الخلايا الليمفاوية التائية المحفزة CCL 19 التي تقع في بوابة الخلايا غير المستقطبة أو المستقطبة.
يمكن ملاحظة الاختلافات في التشكل بين كلا المجموعتين الفرعيتين بوضوح. يمكن أيضا استخدام استراتيجية البوابات التي تم إوضاؤها للتو لرسم النسبة المئوية للخلايا التي تقع في البوابة المستقطبة في حالة عدم وجود CCL 19. كما هو متوقع ، من الواضح أن تحفيز الكيموكين يزيد من النسبة المئوية للخلايا التائية المستقطبة.
يمكن أيضا رسم متوسط مؤشر التدوير لمجموعة الخلايا بأكملها التي تم الحصول عليها في كلتا الحالتين. في الواقع ، يؤدي تحفيز CCL 19 إلى انخفاض في هذا المؤشر. ومع ذلك ، نظرا لأن نصف الخلايا فقط مستقطبة ، فإن التغيير في متوسط مؤشر الدائرية الذي لوحظ عند تحفيز CCL 19 صغير.
في هذه التجربة ، تم تقطيع الخلايا التائية مع GFP مع بلازميدات ترميز الطفرات السلبية السائدة لمركب القطبية السادسة. PKC زيتا. سمح الرسم البياني للخلايا غير المنقولة ببوابة محددة للخلايا التائية الإيجابية GFP ذات الصلة مما يشير إلى أن جزءا صغيرا من مجموعة الخلايا بأكملها قد تم نقلها.
ثم تم قياس درجة الاستقطاب المورفولوجي لهذه الخلايا المنقولة عن طريق قياس مؤشر الدائرية للخلايا الإيجابية GFP فقط ومشية إضافية للخلايا التائية. تم إنشاء إظهار قيم منخفضة من الدائرية لتقدير النسبة المئوية للخلايا المستقطبة في ظل كل حالة مأخوذة. توضح هذه البيانات معا أن تعطيل وظيفة مسار الإشارات PK CZ على قدم المساواة ستة يثبط استقطاب الخلايا التائية الناجم عن كل من الكيموكينات CCL 19 و c Xcl 12.
تمشيا مع النتائج السابقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا العمل دائما عند 37 درجة مئوية طوال خطوة تحفيز الأقارب والتثبيت التالي لضمان استقطاب مورفولوجي قوي وموثوق للخلايا الليمفاوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لتحديد التغيرات في شكل الخلايا وتوطين البروتينات في الخلايا التائية بعد تحفيز الكيموكين. يستخدم قياس التدفق الخلوي مع التصوير لتحليل سريع لأعداد كبيرة من الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
- التصوير الكمي
الخلفية
- تأثير إشارات الكيموكين على شكل الخلية.
- إعادة توزيع البروتينات داخل الخلايا أمر بالغ الأهمية لوظيفة الخلية.
- طرق التصوير المجهري التقليدية محدودة في الإنتاجية.
- قياس التدفق الخلوي مع التصوير يسمح بالتحليل الآلي للعديد من الخلايا.
غرض الدراسة
- لتحديد التغيرات الشكلية في الخلايا اللمفاوية بعد تحفيز الكيموكين.
- لتقييم توطين بروتينات معينة داخل الخلايا المستقطبة.
- لتحسين التحليل الإحصائي من خلال المعالجة عالية الإنتاجية.
الطرق المستخدمة
- تحفيز الخلايا التائية بالكيموكينات.
- التسمية الفلورية للخلايا.
- التحليل عبر قياس التدفق الخلوي مع التصوير.
- تقييم شكل الخلية وتوزع البروتين.
النتائج الرئيسية
- تحصيل سريع لقياس الخلايا اللمفاوية المستقطبة.
- تقييم توزيع العلامات الفلورية.
- تحليل إحصائي متين للتغيرات الشكلية.
- المقارنة مع طرق التصوير المجهري التقليدية.
الاستنتاجات
- قياس التدفق الخلوي مع التصوير فعال لتحليل شكل الخلية.
- تعزز هذه الطريقة من فهم تأثيرات إشارات الكيموكين.
- تسمح بدراسة أعداد كبيرة من الخلايا بكفاءة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput quantification of chemokine-induced cellular polarization and protein redistribution, addressing a key bottleneck in target validation for immunomodulatory drug discovery. By automating morphological and co-localization analysis across thousands of cells, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic de-risking of chemokine receptor pathways. The approach supports scalable, reproducible assessment of compound effects on cell polarity, directly informing go/no-go decisions in preclinical portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chemokine receptor signaling hypotheses through quantitative measurement of actin polarization and phospho-ERM segregation as functional readouts of pathway activation.
- Operational Value: Provides statistically robust data from large cell populations, reducing variability and increasing confidence in target engagement assessments.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by linking receptor stimulation to defined cytoskeletal rearrangements, clarifying biological function before downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a quantitative, imaging-based assay for polarization that captures both shape change and protein redistribution, enabling multiparametric profiling of compound effects.
- Operational Value: Uses imaging flow cytometry to process 5,000+ cells per condition with automated gating, ensuring assay standardization and reproducibility across runs.
- Translational Value: Generates scalable, multiplexable readouts suitable for hit validation and lead optimization in chemokine-targeted screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates utility in evaluating inhibitory compounds (e.g., actin polymerization blockers) and genetic perturbations (e.g., Par6/aPKC mutants), providing a disease-relevant system for pathway-specific de-risking.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of polarized vs. non-polarized subpopulations within the same sample, improving internal control and data interpretability.
- Translational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating morphological polarization with subcellular protein segregation, a hallmark of functional chemokine response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a quantitative bridge between biochemical receptor engagement and functional cellular phenotype. It enables early assessment of whether a compound modulates not just receptor binding but also downstream effector mechanisms critical for immune cell function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying morphological polarization and protein co-localization as direct outputs of chemokine receptor signaling, clarifying pathway activity in primary lymphocytes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining, stimulation, and imaging flow cytometry protocols that produce quantitative circularity and co-localization metrics for compound screening.
- Analytics: Provides RMS gradient, area, circularity, and co-localization readouts that enable statistical comparison of conditions and compound effects on cell polarity.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by establishing a disease-relevant readout (actin/phospho-ERM segregation) that mirrors in vivo polarization events.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, plug-and-play capability for immunology and oncology teams studying chemokine-driven cell migration, adaptable to multiple stimuli and readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in chemokine receptor signaling through direct, multiparametric visualization of polarization events.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability via automated imaging flow cytometry analysis, minimizing user bias and enabling consistent execution across sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insight into functional pathway modulation, reducing late-stage failure due to unanticipated biological complexity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chemokine-targeted candidates based on their ability to induce or inhibit bona fide cellular polarization phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in imaging flow cytometry operation, compensation, and mask-based analysis for morphological and fluorescence parameters.
- Dependent on access to imaging flow cytometry instrumentation and associated software for feature extraction (e.g., RMS gradient, circularity, co-localization).
- Necessitates standardization of cell stimulation, fixation, and staining protocols across users to ensure reproducibility of polarization readouts.
- Requires optimization of chemokine concentration and incubation time for each cell type and stimulus to avoid over- or under-stimulation artifacts.
- Limited to adherent or suspension cells compatible with imaging flow cytometry shear stress; not applicable to fragile or non-viable primary samples without optimization.
