استخدام توقف تدفق الإسفار وإعتبر النيوكليوتيدات لتحليل دورة دوران اعبي التنس المحترفين من Kinesins

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس حركية ارتباط النيوكليوتيدات وتفكيكها خلال دورة دوران A TP للكينيسين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير بروتين كينيسين أولا ، إما خال من النيوكليوتيدات أو محمل بالنيوكليوتيدات المسمى بالفلورسنت. بعد ذلك ، يتم خلط كينيسين المحضر مع النيوكليوتيدات باستخدام مقياس فلوري التدفق المتوقف، ويلاحظ التغيير في التألق المرتبط بربط أو تفكك النيوكليوتيدات المسماة بالفلورسنت.

ثم يكون التغيير في التألق مناسبا لدالة أسية للحصول على ثابت معدل. أخيرا ، يتم تفويض ثوابت المعدل المقاسة وتعزى ثوابت المعدل إلى انتقالات معينة لدورة دوران TP. في النهاية ، يتم استخدام مزيج من النيوكليوتيدات المسماة بالفلورسنت ومضان التدفق المتوقف لقياس حركية ارتباط النيوكليوتيدات وتفكيكها.

CIN ستظهر الإجراء جينيفر باتيل ما بعد الدكتوراه وهانا بيلش ، طالبة دراسات عليا من مختبري. بعد تحديد شدة التألق للكينيسين عند ارتباط النيوكليوتيدات المسماة بالإنسان كما هو موضح في بروتوكول النص بمحلول يصل إلى 20 ميكرومولار كينيسين في مخزن مؤقت خال من المغنيسيوم عند مللي مولار واحد من EDTA ومليمولار واحد من DTT ، احتضان المحلول لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية ، قم بإعداد عمود ترشيح هلام تدفق الجاذبية G 25 SX وتوازن مع ثلاثة أحجام أعمدة على الأقل من المغنيسيوم الخالي من المغنيسيوم مخزن مؤقت. ثم قم بتحميل محلول essin في العمود لفصل النيوكليوتيدات الحرة و EDTA عن كينيسين.

قم بإصلاح أنبوب تجميع عن طريق إضافة حجم 100 ملليمولار محلول كلوريد المغنيسيوم إلى الأنبوب الفارغ ، بحيث يكون التركيز النهائي لكلوريد المغنيسيوم واحدا ملليمول. بعد جمع محلول كينيسين ، باستخدام عازل مناسب خال من المغنيسيوم ، قم بإزالة الكينيسين بسرعة. يساعد وجود كلوريد المغنيسيوم في أنبوب التجميع على استقرار كينيسين مباشرة بعد إيان من العمود ، وتخزين كينيسين على الجليد واستخدامه في غضون ساعة إلى ساعتين.

في غضون ذلك ، قم بإعداد رجل لسلسلة تركيز TP. اختر نطاق التركيزات وفقا للتركيز المتاح من كينيسين. لكل تركيز من الوش ، قم بإعداد TP تركيزا مناسبا من كينيسين بحيث يكون الرجل المسمى النيوكليوتيدات في خمسة إلى عشرة أضعاف زيادة مولية على مواقع ربط نيوكليوتيدات كينيسين.

اضبط الطول الموجي للإثارة على مقياس التدفق المتوقف: 365 نانومتر ، والطول الموجي للانبعاث فوق 400 نانومتر باستخدام مرشح مرور طويل. بعد ذلك ، بدءا من أقل تركيز من Manta TP ، استخدم مقياس فلور التدفق المتوقفة لخلط شيطان شيطان التيبول والكينيسين الخالي من النيوكليوتيدات بنسبة حجم واحد إلى واحد إلى الحجم. باستخدام الصيغة التالية ، قم بملاءمة التغيير في مقياس شدة التألق لتعليم تركيز الواح A TP إلى دالة أسية ، بالإضافة إلى خط من المنحدر السالب الثابت لحساب التبييض الضوئي لمجموعة المانت.

من هذه النوبات تحديد معدل ثابت عند كل تركيز من الوش. ثم يقوم TP بتفويض معدلات الارتباط والتفكك عن طريق استخدام kops بالخيط مقابل تركيز الوش. ج: TP: ثم قم بتركيب هذه البيانات في دالة خطية للحصول على تقاطع التدرج والمحور y.

يمثل التدرج ثابت المعدل للإنسان ارتباط TP بوحدات لكل مولر في الثانية. يمثل التقاطع ثابت معدل التفكك مع الوحدات في الثانية. لقياس معدل التفكك الثابت ، قم بتخمير DP إلى محلول اثنين من كينيسين ميكرومولار في مخزن مؤقت مناسب عند 50.

تعني Micromolar حاضنة DP 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد استخدام عمود G 25 Sedex لإزالة الوشاح الفري ، A DP من kinesin ، محمل ب mant A DP ، وتعيين فلوتر إيقاف التدفق كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، استخدم التدفق المتقطع لخلط مركب الوشاح A DP Kinine مع فائض مولاري بمقدار 50 ضعفا أو أكثر من A TP غير المسمى في تناسب حجم واحد إلى واحد لنسبة الحجم. لوحظ الانخفاض في شدة التألق بمرور الوقت إلى دالة أسية واحدة ، بالإضافة إلى خط من المنحدر السلبي الثابت للسماح بالتبييض الضوئي للمجموعة.

kops المحددة من هذا الملاءمة هي ثابت المعدل لتفكك mant A DP بوحدات في الثانية. يعتمد حجم تغيير الإشارة عند ربط أو تفكك نيوكليوتيدات الخشب الوشاح على كينيسين معين. لذلك ، من المفيد إجراء قياسات التوازن أولا لتأكيد وجود وحجم تغير شدة الفلورسنت.

هنا أطياف الفلورسنت تخمر TP وتعني DP في كل من المحلول والمركب من kinesin M CAC. يصور هذا الشكل التفاعل الذي يحدث عند خلط الإنسان TP مع كينيسين الخالي من النيوكليوتيدات. تظهر هنا الزيادة في شدة التألق التي تحدث عند ارتباط الإنسان A TP ب M CAC ، مما يتناسب مع ثابت المعدل مقابل الرجل.

تركيز TP إلى دالة خطية كما هو موضح هنا بفك الالتفاف لثابت المعدل الذي يساهم في kops ويوفر تخمير معدل الارتباط ومعدل التفكك A TP. يوضح هذا الشكل انخفاض شدة التألق الملحوظ في التخمير A DP عند التفكك من M CEC كما هو موضح هنا. يتم تحديد ثابت المعدل لتفكك mant A DP من Kinesin عن طريق ملاءمة هذه البيانات مع دالة أسية. بمجرد إتقان هذه البروتوكولات ، يمكن إكمال كل منها في أقل من ثلاث ساعات.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على كينيسين ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على بروتينات ربط النيوكليوتيدات الأخرى ، مثل بروتينات الميوسين و G. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام النيوكليوتيدات المصنفة بالفلورسنت ومقياس التدفق التوقف لقياس حركية ارتباط النيوكليوتيدات وتفككها في كينيسين.