Regioselective Biolistic استهداف عضوي في الدماغ شرائح باستخدام بندقية الجينات المعدلة

الهدف من هذا الإجراء هو نقل أو تسمية مناطق مميزة من شرائح النمط العضوي بسرعة وكفاءة باستخدام مسدس الجينات. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد شرائح عضوية قابلة للحياة من الدماغ أو الأنسجة الأخرى. الخطوة الثانية هي إنتاج الحمض النووي أو جزيئات الذهب التي تم فك تشفيرها للتوصيل الحيوي.

بعد ذلك ، يتم وضع شريحة النمط العضوي تحت حامل مسدس جيني مستقر ويتم إطلاق الجسيمات المطلية في الأنسجة أو التحول العرضي أو وضع العلامات. الخطوة الأخيرة هي مراقبة أو تحليل تأثير الجينات غير المتجانسة التي يتم تسليمها إلى المناطق المعزولة. في النهاية ، يسمح هذا النهج للمستخدم بنقل مناطق مميزة من شرائح الأعضاء بدقة مع جينات مختلفة غير متجانسة.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على الطرق الحالية هي أن الخدمات اللوجستية الحيوية تسمح للخلايا المتمايزة بشكل نهائي ، بالإضافة إلى الحد من نصف قطر العمل إلى قطر صغير. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم الأسئلة العصبية الحيوية الرئيسية ، مثل فهم المساهمة الإقليمية لجين واحد. ابدأ هذا الإجراء بوضع دماغ جديد في قالب متلقي صغير.

قم بتغطيته بمحلول ARO ، والذي تم استدعاؤه أعلى قليلا من درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتبريد القالب بسرعة إلى أربع درجات مئوية عن طريق وضعه على الجليد. عندما يثبت الحروس.

بعد خمس إلى 10 دقائق ، قم بإزالة الدماغ المدمج من القالب. بعد ذلك ، قم بلصقه على منصة التقطيع الليفية. بعد ذلك ، انقل المنصة إلى غرفة تقطيع Vibra التي تحتوي على PBS معقم بارد.

بعد التقطيع ، ضع الشرائح برفق على إدخالات زراعة الخلايا في صينية متعددة الآبار بستة آبار مع وسائط مزرعة على السطح الخارجي للإدخال. احتضنها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في هذا الإجراء ، قم بإعداد المقذوفات النانوية باستخدام جزيئات ذهب قطرها 40 نانومتر عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من المنوية 0.05 مولار ، و 10 ميكرولتر من الحمض النووي بمعدل واحد ملليغرام لكل مليلتر إلى 10 ملليغرام من جزيئات الذهب.

ثم أضف كلوريد الكالسيوم في خليط المحلول للمساعدة في ارتباط جزيئات الحمض النووي بجزيئات الذهب النانوية. بعد ذلك ، ارسم المحلول في الأنبوب باستخدام حقنة. ضع الأنبوب في محطة تحضير الأنبوب.

دع جزيئات الذهب تستقر. ثم قم بإزالة supinate عن طريق الشفط باستخدام حقنة. قم بتدوير الأنبوب لتوزيع جزيئات الذهب بالتساوي.

بعد ذلك ، جفف الجزيئات تحت تدفق مستمر للنيتروجين بمعدل خمسة لترات في الدقيقة. لإنشاء رصاصات الحمض النووي ، قم بتقطيع الأنبوب إلى قطع سنتيمتر واحد باستخدام قاطع الأنابيب. ثم قم بإدخالها على الفور في الخرطوشة المزروعة بالجين أو احتفظ بها جافة عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامها في غطاء تدفق صفيحة معقم ، وقم بتحميل الخرطوشة التي تحتوي على الذهب المطلي بالحمض النووي في حامل الخرطوشة.

ثم قم بتحميل الحامل في مسدس الجينات. قم بتوصيل برميل مسدس الجينات المعدل به باستخدام ملقط معقم. ضع حشوة مرشح تحتوي على شريحة عضوية في طبق بلاستيكي معقم.

قم بإزالة الوسائط من شريحة النمط العضوي. بعد ذلك ، اضبط ضغط الغاز على 50 رطل لكل بوصة مربعة باستخدام الحامل. ضع مسدس الجينات على مسافة 10 ملليمترات فوق المنطقة المرغوبة من الشريحة للتسليم الجيني.

ثم صوب بعناية في مركز البرميل وأطلق الجزيئات المطلية في الأنسجة. بعد التعداء الحيوي ، اغسل الشريحة برفق مرتين باستخدام PBS. ثم قم بإصلاح الشريحة عن طريق احتضان 4٪ PFA مثلج في PBS لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الشريحة مرتين في PBS. مرة أخرى ، قم بقص الغشاء برفق بعيدا عن الملحق باستخدام مشرط دون إزعاج الشريحة. ثم ضع دعامة الغشاء على شريحة مجهرية بالملقط واترك شريحة النمط العضوي تستقر عليها.

بعد ذلك ، أضف قطرة واحدة من وسائط التثبيت على الشريحة. ضع زلة الغطاء برفق دون أي قوة على اتصال مباشرة بالأنسجة. بعد ذلك ، قم بتأمين زلة الغطاء بطبقة رقيقة من طلاء الأظافر.

يوضح هذا الشكل التوصيل الحيوي للحمض النووي المشفر بالبروتين الفلوري في شريحة النمط العضوي لفأر عمره ستة أسابيع. كما يتضح من هنا ، تظهر خلية البكيني العصبية ذات الميناء الشجيري الرائع الموجود في واجهة طبقة البكيني والطبقة الجزيئية للمخيخ ملصقات واضحة بعد تعداء حيوي عابر مع P-E-G-F-P-N واحد. هنا تكبير أعلى للتشعبات مع العمود الفقري ، وهنا خلية شبه معدنية موجودة في منطقة واحدة من الحصين.

بعد التسليم الحيوي لجسيمات الذهب النانوية المطلية ب PDS Red FP بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعات قليلة فقط خلال فترة ثلاثة إلى أربعة أيام بعد هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل الفحص المجهري متحد البؤر للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية ارتباط بعض الخلايا العصبية بالمناطق المجاورة.