طرق ترانسفكشن الخلايا العصبية

يُعد التعداء (Transfection) - وهو نقل المادة الوراثية إلى خلايا الثدييات - أداة قيمة تسمح للعلماء بالتلاعب جينيًا بالعصبونات والأنسجة العصبونية. وتجعل الخصائص الفريدة لهذه الخلايا الحساسة عملية التعداء تحديًا يتطلب تقنيات متخصصة.

ستستعرض هذه المادة المبادئ الكامنة وراء تعداء العصبونات، وتقدم الاستراتيجيات الشائعة المستخدمة في هذه الخلايا، بما في ذلك التعداء النووي (nucleofection)، والتعداء الحيوي (biolistic transfection)، والنقل الفيروسي (viral transduction). وأخيرًا، سنناقش تطبيقات تقنيات التعداء في أبحاث العلوم العصبية الخلوية والجزيئية.

لنبدأ بمراجعة كيفية عمل عملية عفن الخلية (transfection). في حين أنه يمكن إيصال المادة الوراثية إلى مقربة من خلية مستنبتة عن طريق إضافتها إلى الوسط المحيط، إلا أن النوكليوتيدات لا يمكنها اختراق الأغشية الخلوية بكفاءة.

لقد صُممت جميع بروتوكولات عفن الخلية لتمكين المادة الوراثية من تجاوز هذا الحاجز. يمكن للنوكليوتيدات التي تمنع إنتاج البروتين، مثل الرنا الصامت (silencing RNA)، أن تؤدي وظيفتها فور دخولها إلى السيتوبلازم. ومع ذلك، يجب نقل البنى القائمة على الحمض النووي DNA إلى النواة من أجل الترجمة قبل أن تبدأ عملية تخليق البروتين.

في الخلايا التي تنقسم، يمكن أن يؤدي تفكك الغلاف النووي أثناء الانقسام الفتيلي إلى دمج الحمض النووي DNA المنقول في نوى الخلايا الوليدة التي تتشكل. ونظراً لأن معظم العصبونات المستنبتة هي خلايا ما بعد الانقسام - أو خلايا غير منقسمة - فإن الأمر يتطلب بروتوكولات عفن خلوي متخصصة من أجل تحفيز التعبير الجيني بنجاح.

لنبدأ نظرتنا العامة على هذه البروتوكولات بعملية النوكليوفيكشن (nucleofection). تعتمد هذه التقنية على مزيج من مجال كهربائي مستحث وكواشف كيميائية، يعملان معاً لإنشاء بنى مؤقتة تشبه المسام في كل من الأغشية الخلوية والنووية. وبما أن النيوكليوتيدات مشحونة، فإن المجال الكهربائي يدفع أيضاً حركة الـ DNA عبر هذه المسام.

لتنفيذ هذا الإجراء، يتم تجميع العصبونات العالقة في شكل كريّة عن طريق الطرد المركزي قبل إعادة تعليقها في كاشف نوكليوفيكشن تجاري. ثم يتم خلط المزيج الخلوي مع الـ DNA المنقى ونقله إلى كيوفيت (cuvette) خاصة بالثقب الكهربائي، والتي تتميز بوجود لوحين من الألومنيوم يعملان كوصلة كهربائية مع جهاز النوكليوفيكتور (Nucleofector). يرسل هذا الجهاز سلسلة من النبضات الكهربائية السريعة، والتي يتم تخصيص عددها ومدتها بناءً على نوع الخلايا. وبعد عملية النوكليوفيكشن، يمكن تخفيف الخلايا في وسط استزراع وزرعها لمواصلة النمو.

بدلاً من ذلك، تعمل تقنية مسدس الجينات على اختراق حواجز transfection عن طريق إطلاق رصاصات تحمل مادة وراثية عبر كل من الغشاوات الخلوية والنووية.

لصنع رصاصات مسدس الجينات، يتم ترسيب الـ DNA الذي يشفر الجين المطلوب على حبيبات بمقياس الميكرون، وتكون عادةً مكونة من الذهب. بعد تحضين لمدة 10 دقائق، تُغسل الحبيبات وتُنقل إلى أنابيب. ثم يتم تدوير الأنابيب أثناء جفاف المحلول، مما ينتج عنه تغطية موحدة للحبيبات. بعد ذلك، تُقطع الأنابيب إلى خراطيش وتُشحن في المسدس. ويمكن إجراء عملية توصيل الحمولة الوراثية بواسطة الغاز على الخلايا التي تنمو في أطباق زراعة قياسية بمجرد سحب الزناد.

وأخيراً، يستفيد نقل الجينات الفيروسي من دورة حياة الفيروس لإدخال مادة وراثية غريبة إلى النواة. يتم تعبئة الـ RNA الذي يشفر الجين المطلوب في فيروسات قهقرية معدلة تُعرف بنواقل الفيروسات البطيئة (lentiviral vectors)، والتي تدخل إلى الخلايا المستهدفة عن طريق الارتباط ببروتينات غشائية محددة، مما يحفز عملية اندماج الغشاء. ثم يتم نسخ الـ RNA الفيروسي عكسياً إلى شريط DNA مكمل يُنقل إلى النواة.

قبل البدء في هذا الإجراء، يرجى ملاحظة أن الفيروسات يمكن أن تصيب خلايا جسمك كما تصيب الخلايا الموجودة في الطبق، لذا فإن اتباع إرشادات السلامة أمر بالغ الأهمية.

تتمثل الخطوة الأولى في توليد جسيمات الفيروسات البطيئة التي تحمل الجين المطلوب. ويتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير عن اللبنات الأساسية للفيروس في خط خلايا بشرية مُحسّن لإنتاج الفيروسات، مثل خلايا 293T. ولتجنب الانتشار غير الضروري للفيروسات المهندسة وراثياً، يتم الاحتفاظ بالجينات المطلوبة لتجميعها منفصلة عن ناقل النقل (transfer vector)، الذي سيتم تضمين تسلسله في الجسيم المعدي.

يستغرق الأمر حوالي يومين حتى يتم إطلاق الفيروسات المجمعة بالكامل في وسط الزرع، حيث يمكن جمعها وتركيزها عن طريق الطرد المركزي الفائق (ultracentrifugation). بعد ذلك، يتم تحديد التركيز المناسب للفيروس، أو ما يعرف بالعيار (titer)، من خلال تقييم نجاح عملية النقل في خط خلايا تجريبي. ثم يُضاف ناقل الفيروسات البطيئة إلى المزرعة العصبية المستهدفة، وعادة ما يتم تحضينها لمدة تتراوح بين 24 إلى 48 ساعة لضمان حدوث العدوى.

بعد أن أصبحت على دراية بتقنيات عفن الخلية (transfection) الشائعة، سيعتمد اختيارك للتقنية المناسبة على الأهداف المحددة لتجاربك. لنلقِ نظرة على بعض الأمثلة.

بدايةً، تتيح مراقبة نضوج الخلايا العصبية في المزرعة إجراء تحليل مفصل للتغيرات المورفولوجية الهامة للترابط العصبي، مثل تكوين الأشواك التغصنية. ولتصوير مورفولوجيا الخلايا بمرور الوقت، استخدم هؤلاء الباحثون تقنية النوكليوفيكشن (nucleofection) لإيصال بروتين فلوري إلى الخلايا العصبية المستزرعة. هنا، تم عفن بروتين tubulin موسوم فلورياً في مجموعة فرعية من الخلايا، مما أتاح إجراء تحليلات مفصلة لزوائد الخلايا عبر المجهر الفلوري. ونظراً للحفاظ على مستويات التعبير طوال فترة حياة الخلية العصبية، أمكن إجراء التحليل المورفولوجي لمدة شهر واحد على الأقل في المزرعة.

يمكن استخدام عفن الخلية أيضاً لاختبار تأثير طفرات جينية محددة على وظيفة الخلايا العصبية. حيث يمكن استخدام مسدس الجينات (gene gun) لإيصال DNA يشفر نسخاً برية (wild type) أو طافرة من البروتين، ومن ثم تقييم التأثيرات قصيرة المدى على البيولوجيا الخلوية، على سبيل المثال عن طريق تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp recording) لنشاط الخلايا العصبية.

وأخيراً، تتمثل استراتيجية شائعة لاختبار وظيفة الجين في مراقبة ما يحدث للخلايا عند حجب تعبيره. وفي هذه التجارب، يمكن استخدام النواقل الفيروسية البطيئة (lentiviral vectors) لإيصال بنيات RNA الإسكاتية، التي تمنع تخليق البروتين. وفي هذه التجربة، يؤدي تثبيط (knockdown) الجينات المرتبطة بمرض باركنسون إلى انخفاض ملحوظ في حيوية الخلايا.

لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول ترنسفكشن العصبونات. لقد عرضنا في هذا الفيديو مبادئ ترنسفكشن العصبونات، بالإضافة إلى الإجراءات والتطبيقات لثلاث استراتيجيات ترنسفكشن شائعة.

شكراً للمشاهدة!