الاشتقاق وتوصيف خالية من التحوير الإنسان المستحثة متعددة القدرات خط الخلايا الجذعية والتحويل إلى تعريف الحالات السريرية الصف

الهدف العام من التجربة التالية هو اشتقاق الخلايا الجذعية متعددة القدرات المعاد برمجتها القائمة على الفيروسات العدسية الخالية من العوامل التي يسببها الإنسان وتحويل هذه الخلايا إلى ظروف سريرية مفترضة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية الجلدية الأولى باستخدام كاسيت واحد كبير للخلايا الجذعية الفيروسية أو سيارة جذعية في HI PSCs. بعد ذلك ، تتعرض PSCs المعاد برمجتها HI لفيروس adeno Cree خرخرة للاستئصال الكامل وإزالة السيارة الجذعية من الجينوم المضيف.

ثم يؤكد استخراج الحمض النووي الجيني من HI PSCs الخالية من المغذي ، متبوعا بتحليل agel استئصال السيارة الجذعية المناسب. أخيرا ، يتم تحويل العامل الثالث H IPCs إلى ظروف درجة GMP مفترضة من خلال منهجية تحويل بطيئة إلى ظروف خالية من xeno محددة بالكامل. في النهاية ، تؤكد إعادة البرمجة الفيروسية للأرومات الليفية الجلدية البشرية البالغة والتحويل الكامل ل H IPCs إلى ظروف من الدرجة السريرية على قابلية التطبيق الواسع لهذه المنهجية لإعادة برمجة الخلايا البشرية البالغة وتحويلها إلى حالات ذات صلة سريريا.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى التطبيقات السريرية للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية لأنها خالية تماما من العوامل وتتحول إلى ظروف من الدرجة السريرية ، مما يجعلها متوافقة مع العلاجات البشرية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم إعادة برمجة الاستئصال وخطوات التحويل السريرية بسبب الإجراءات الرئيسية المعقدة والمحددة التي يجب اتباعها لإنتاج العامل الثالث والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية من الدرجة السريرية لبدء الذوبان. الخلايا الليفية البشرية الجلدية البالغة أو HAF في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

الحرص على عدم غمر الجزء العلوي من القارورة في الماء. ضع ملاط واحد ملليلتر من الخلايا في قارورة وقائع 15 ملليلتر لإعادة تعليق الخلايا وتخفيف DMSO بطريقة متساقطة. أضف ببطء أربعة ملليلتر من الطرد المركزي المتوسط المسخن مسبقا البنفسجي 200 مرة جم لمدة 10 دقائق من درجة حرارة الغرفة.

ثم استنشق sup, nacent و reus. الخلايا في متوسط إلى 100 ، 000 خلية لكل مليلتر في بئر واحد من ستة ألواح جيدة إلى 0.2٪ جيلاتين. أضف ملليلترين من تعليق الخلية ، ثم أضف ملليلترين من التعليق إلى الثانية.

حسنا ، لاستخدامها لقياس تعدد العدوى أو وزارة الداخلية ، قم بهز اللوحة من جانب إلى آخر وذهابا وإيابا لتوزيع الخلايا بالتساوي قبل احتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في غرفة رطبة. بعد 24 ساعة بعد عد الخلايا ، تذوب الخلايا مرتين ، قم بتوسيط وحدات النقل الثماني أو S من تركيز الفيروسات العدسية المكافئ واستخدم وسط huff لتخفيفه إلى مرة واحدة في 10 إلى ثمانية طن لكل مليلتر باستخدام نصف متوسط مكمل بثمانية ميكروغرام لكل مليلتر من كاشف التعداد. نقل الخلايا بنسبة 10 تعدد من العدوى.

امزج الآبار المحولة بالتساوي واحتضانها طوال الليل بعد حوالي 24 ساعة من نقل الفيروسات. قم بإزالة وسط الرفع واستبدله بخلية جذعية بشرية قياسية متعددة القدرات أو وسط PSC. قم بتغيير الوسط يوميا في الأيام من الثاني إلى السادس في اليوم السادس إلى طبقين مطلي بالجيلاتين بنسبة 10 سم 1.5 إلى 1.75 مرة 10 إلى الخلايا الليفية الجنينية الستة المشتقة من العامل المكون التكميلي الأول أو الفئران الكيسي في نصف متوسط في اليوم السابع.

أضف رحلات درجة حرارة الغرفة إلى بئر واحد من ستة ألواح من الخلايا الليفية المعاد برمجتها. ترفع الخلايا برفق وتدور 100 مرة G مع لوحة متوسطة PSC بشرية جديدة جميع الخلايا بنسبة واحد إلى 16 على لوحين من الميثامفيتامين CFI بطول 10 سم. قم بتوزيع الركام في حركة حلزونية في اتجاه عقارب الساعة واحتضانه لمدة 48 ساعة تقريبا قبل استبدال الوسط.

بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع ، استخدم إبرة قياس 21 لاختيار ثماني إلى 10 قطع فردية من مستعمرات محددة مع ESC نموذجي مثل التشكل واستنساخها في آبار فردية من CFI MFS بعد التوسع. تأكد من أن الخلايا متعددة القدرات عن طريق تكوين جسم الجنين وتحليل تعبير العلامة بعد التحقق من موقع تكامل السيارة الجذعية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. سيارة الجذعية عن طريق السحب أولا من وسط PSC البشري القديم إلى ثلاثة ملليلتر من وسط PSC القياسي مجتمعة.

45 ميكرولتر من الأدينو المركز كري بور أو الفيروس مع ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر من عوامل التعداد. ثم أضفه إلى الخلايا واحتضن لمدة 24 ساعة بعد الحضانة ، واستنشق الفيروس ، ويحفز وسط PSC البشري لغسل الخلايا مرتين. ثم أضف وسط HPSC مع ميكروغرامين لكل مليلتر من المايسين النقي واستبدلها يوميا بعد خمسة أيام ، واستنساخ المستعمرات المتبقية وتوسيعها كما هو موضح سابقا في الفيديو.

بعد ذلك ، قم بإذابة قارورة واحدة من مصفوفة الغشاء القاعدي قبل Eloqua على الجليد وتخفيف الوسط القاعدي البارد إلى تركيز نهائي من واحد إلى 30. استخدم ملليلتر واحد لكل بئر لتغطية العدد المطلوب من الآبار من ستة آبار واترك اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم باستخدام إبرة قياس 18 ، قم بالتظليل المتقاطع ما لا يقل عن 20 إلى 30 مستعمرة من بئر مغلفة مسبقا ب mes.

احرص على تقليل رفع الخلايا ونقل الخلايا من اللوحة. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، قم بشفط المصفوفة من البئر المطلي بماصة سعة 200 ميكرولتر. قم بإزالة قطع المستعمرات عن طريق كشطها برفق من اللوحة القديمة وضعها بعناية في ثلاثة ملليلتر من الوسط المركب حديثا ، واحد في صفيحة مطلية بالمصفوفة.

بعد الحضانة لمدة 48 ساعة ، قم بتغيير الوسيط يوميا عندما تصل PSCs المحولة الخالية من التغذية إلى 80٪ من الطلاقة. استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية لاستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام البادئات الموضحة هنا والتي تكون خاصة بالتكاملات الخارجية لفيروس عدس السيارة الجذعية. قم بتحليل الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للاستئصال المناسب لنقل PSCs اللاحقة إلى ظروف درجة GMP.

امزج HPSC المدمجة المتوسطة واحدة والدرجة السريرية المتوافقة مع GMP المتوسطة أو المتوسطة المركبة اثنين بنسبة 80 إلى 20 قبل التسخين إلى 37 درجة مئوية. استنشق الوسط القديم المركب من الخلايا واستبداله بثلاثة ملليلتر من المحلول المتوسط الدافئ الجديد. استبدل الوسيط يوميا لمدة ثلاثة أيام يمر وفقا لبروتوكول النص للحفاظ على حجم المستعمرة وكثافتها المناسبة في اليوم الرابع ، واستبدل الوسط بمزيج 50 50 من الوسائط المدمجة الدافئة واحدة واثنتين تحتضن لمدة ثلاثة أيام.

استبدال الوسط يوميا في اليوم السابع ، قم بالتبديل إلى نسبة 20 إلى 80 من الوسائط المدمجة الدافئة واحد واثنين على التوالي واستبدلها يوميا لمدة ثلاثة أيام. في اليوم 10 ، قم بالتبديل إلى دافئ ، 100٪ متوسط مدمج وقم بالتغيير يوميا. الخلايا الآن في وسط خال من xeno محدد تماما.

بعد ذلك ، بعد استخدام ركيزة محددة خالية من xeno لطلاء بئر واحد من ستة آبار ، استبدل الوسط الخالي من xeno في بئر من خلايا التقاء بوسط جديد يحتوي على صخرة x واحدة. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، استخدم إبرة قياس 18 لإدخال الخلايا ميكانيكيا إلى الخلايا المعدة حديثا. حسنا ، اسمح للخلايا بالتحتضن دون إزعاج لمدة يومين للسماح بأقصى قدر من التعلق قبل توصيف الخلايا وفقا لبروتوكول النص.

يوضح هذا الشكل صورة تمثيلية لثلاثة خطوط مختلفة H-I-P-S-C مقطوعة مسبقا بعد إعادة البرمجة باستخدام نهج السيارة الجذعية على طبقة من mes الموضحة هنا هو جل PCR للنسخ العكسي بعد الاستئصال يظهر استنساخا فرعيا معينا خاليا تماما من فيروس العدسات للسيارة الجذعية كما يتضح من عدم وجود نطاق أمبليكون خاص لتسلسل معين داخلي المنشأ للسيارة الجذعية. في هذا الشكل ، يتم عرض IPCs المحولة مسبقا على مصفوفة تحتوي على xeno وما بعد المكوس من GMP من الدرجة H IPCs على المصفوفة الاصطناعية الكمية للعوامل المرتبطة بالقدرة المتعددة القياسية ، بما في ذلك SOX two و OCT four و nanog. يتم توضيح استخدام QPCR هنا.

أخيرا ، كما هو موضح هنا ، تم اختبار شروط PSCs عالية الأبعاد المحولة مسبقا والمحولة بعد إلى ظروف درجة GMP من خلال قياس التدفق الخلوي لحمض السياليك وحمض الجليكول العصبي الذي يدل على مستضدات غير بشرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة باستخدام فيروس إعادة برمجة stemco ، واستئصال الفيروس من الجينوم ، ثم تحويل HI PSCs بالكامل إلى ظروف من الدرجة السريرية متوافقة تماما مع العلاجات البشرية. لا تنس أن العمل مع staca ، وهو ناقل مضاد للفيروسات من الجيل الثالث يمكن أن يكون خطيرا للغاية واحتياطات.

يجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة وغرفة زراعة الأنسجة VSL two plus أثناء تنفيذ هذا الإجراء.