هجين طريقة استخراج الحمض النووي للتقييم النوعي والكمي للمجتمعات البكتيرية من عينات الدواجن الإنتاج

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير تقنية جديدة لاستخراج الحمض النووي تجمع بين تجانس الحمض النووي الميكانيكي وإزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل والمعيار الذهبي وطريقة الاستخراج الجسدي للعينات البيئية على طول سلسلة إنتاج الدواجن. يتم تحقيق ذلك عن طريق تقسيم عينة بيئية أولا إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة تحتوي على خليط من الخرز لتجانس العينات البيئية المعقدة بشكل فعال. الخطوة الثانية هي وضع الأنابيب في خالط عالي الطاقة لإطلاق الأحماض النووية بكفاءة من الخلايا البكتيرية والمصفوفة البيئية.

بعد ذلك ، يتم استخدام الجانس كمادة أولية لطريقة استخراج الحمض النووي الأنزيمي القياسي الذهبي من خلال مرحلة ربط تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تتمثل الخطوة الأخيرة في وضع العينات في محطة عمل روبوتية لاستخراج الحمض النووي لتزويد المستخدم بعينات الحمض النووي المستخرجة القابلة لمجموعة من التطبيقات النهائية ، وفي النهاية تم استخدام تحليل PCR الكمي والميكروبيوم باستخدام منصة MiSeq المصنوعة من الألومنيوم ، لإظهار أن هذه الطريقة الهجينة الجديدة توفر أفضل مزيج من التقييمات النوعية والكمية لإجمالي المجتمعات البكتيرية مقارنة بمعالجة العينات بطريقة الاستخراج الميكانيكية أو الأنزيمية منفرد. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتحليل المجتمعات الميكروبية على طول سلسلة إنتاج الدواجن ، ولكن يمكن تطبيقها أيضا على النظم الزراعية الأخرى مثل أبقار الخنازير أو إنتاج المحاصيل التي تحتوي على عينات بيئية معقدة مماثلة.

ستظهر هذا الإجراء اليوم كايتلين جريفين ، طالبة في مختبري. لبدء التجربة ، اضبط حماما مائيا على 95 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بوزن ثلاث نسخ مكررة من 0.33 جرام لتحليل ما مجموعه جرام واحد من درجة حرارة الغرفة أو التربة أو المواد البرازية في قفازات تغيير أنبوب ET مصفوفة ملليلتر بين العينات.

أضف 825 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم و 275 ميكرولترا من محلول ما قبل التحلل أو PLS إلى أنبوب العينة. ثم قم بتدوير العينات لمدة 15 ثانية بعد خلط أجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 14 ، 000 جي ثانية لمدة خمس دقائق. صب المادة الطافية وإضافة 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت A SL. ثم دوامة الأنبوب لمدة خمس ثوان.

افتح أنبوبا واحدا في كل مرة لمنع التلوث. بعد ذلك ، تأكد من وجود مسافة رأس تبلغ 10٪ من الحجم الكلي في الأنبوب المخروطي قبل وضع العينات في أداة الإعداد السريع 24. تجانس العينات بسرعة ستة أمتار في الثانية لمدة 40 ثانية.

لاحظ الفرق بين الإعداد السريع 24 والدوامة بعد التجانس. الطرد المركزي العينة عند 14 ، 000 Gs لمدة خمس دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة ملليلترين إلى العينة المتبقية في أنبوب ET لمصفوفة التحلل عند 700 ميكرولتر إضافي من محلول SL لإعادة التجانس والطرد المركزي.

باستخدام الإعدادات السابقة ، ضع مشابك قفل بلاستيكية على أنابيب العينة للتأكد من أنها لن تنفتح وتحتضن المواد الطافية في حمام مائي بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، افتح كل أنبوب طرد مركزي صغير لتحرير الضغط ، وقم بتلخيص الأنابيب ودوامها لمدة 15 ثانية. الطرد المركزي للعينات في 14 ، 000 GS لمدة دقيقة واحدة.

بعد الطرد المركزي ، قم بنقل 1.2 مل من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة ملليلتر. ثم ضع عبوة الفقاعة التي تحتوي على اللسان مباشرة فوق أنبوب الطرد المركزي الصغير المفتوح وادفع اللسان برفق خارج عبوة الفقاعة إلى الأنبوب. لتجنب التلامس بين علامة التبويب المثبطة X والأنبوب ، أضف علامة تبويب X مثبطة واحدة لكل عينة.

بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب حتى تتحول العينات إلى سائل أبيض مائل للصفوف. احتضان العينات لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وقم بطردها عند 14،000 جبن لمدة خمس دقائق مع تجنب أي جزيئات متبقية في قاع الأنابيب. انقل كل السوائل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل.

ثم الطرد المركزي الأنابيب بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق. قبل البدء في تنقية الحمض النووي الآلي، تأكد من أن محطة العمل تحتوي على الكمية المناسبة من أطراف المرشح والمخازن المؤقتة. بعد ذلك ، أضف الأنابيب الإيضوية وأنابيب الترشيح إلى محولات الدوار وأضف 400 ميكرولتر من كل عينة إلى الفتحة الوسطى لمحول الدوار.

ضع محولات الدوار في جهاز الطرد المركزي لمحطة العمل وتأكد من تأمين جميع أغطية أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة بشكل صحيح داخل محول الدوار. أضف محلول البروتيناز K إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر وضعه في الفتحة A في محطة العمل. أضف أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن المليلتر إلى قسم شاكر محطة العمل ، وتأكد من وضع أغطية أنابيب العينة بشكل آمن.

باستخدام شاشة اللمس على محطة العمل ، حدد بروتوكول الكشف عن مسببات الأمراض في البراز البشري في براز الحمض النووي واقرأ الشاشات اللاحقة للتأكد من تحميل محطة العمل بشكل صحيح. بمجرد اجتياز جميع شاشات الفحص ، حدد بدء تشغيل البروتوكول. ثم قم بإزالة العينات من محولات الدوار.

اجمع بين عمليات التنقية الثلاثة المكررة لعينة فردية باستخدام نظام قائم على التبخر بالطرد المركزي. أعد إزالة العينة إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر باستخدام عازلة tris EDTA. أخيرا ، قم بتغطية العينات ووضعها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة إليها لتحليلها في المصب.

يوضح هذا الرسم البياني أن الطريقة الميكانيكية قدمت باستمرار أعلى تقديرات إجمالية إجمالية لوفرة الجينات الطبيعية البكتيرية لعينات البراز والقمامة. كان للطريقة الأنزيمية أدنى التقديرات في جميع الحالات. أنتجت طريقة الاستخراج الهجينة الجديدة أفضل مزيج من تقديرات المجتمع البكتيري الإجمالية النوعية والكمية.

من طرق الاستخراج الثلاث التي تم اختبارها. يجب أن يكون لديك الآن فهم أفضل لكيفية إجراء هذه الطريقة الجديدة شبه الآلية لاستخراج الحمض النووي الهجين ورؤية فائدتها في التقييم النوعي والكمي للمجتمعات الميكروبية من العينات البيئية المعقدة.