القوة الذرية الميكروسكوب من الضوء الأحمر الخلايا المستقبلة عن طريق رسم الخرائط PeakForce الكمية النانوميكانيكية الملكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع صور عالية الدقة لبروتينات المستقبلات الضوئية باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على عينة من المستقبل الضوئي وتخفيفها. الخطوة الثانية هي تطبيق عينة البروتين على سطح الميكا المشقوق والنظيف لمدة 30 ثانية تقريبا.

ثم يتم شطف MICA بمخزن مؤقت لإزالة الجزيئات غير المرتبطة وغير المرتبطة بشكل فضفاض. بعد ذلك ، يتم توصيل العينة بخلية سائلة مجهزة بمسبار مناسب. يتم تحميل هذه المجموعة على الماسح الضوئي.

بعد ملء الخلية السائلة بمحلول عازل ، قم بإشراك الطرف بالعينة وابدأ في المسح. في النهاية ، الفحص المجهري للقوة الذرية يشتمل على قوة الذروة. يستخدم رسم خرائط الخصائص الميكانيكية النانوية الكمي لجمع صور لبروتين مستقبلات ضوئية واحدة على سطح العينة.

يمكن للفحص المجهري للقوة الذرية الذي يشتمل على قوة الذروة q و m الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية ، مثل ما هي الخصائص الهيكلية والكيميائية المهمة التي تحدد وظيفة الجزيئات الكبيرة النشطة بيولوجيا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية هي أنه يمكن الحصول على صور عالية الدقة للبروتينات السليمة والجزيئات البيولوجية الكبيرة الأخرى في بيئة ذات صلة بيولوجيا. بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن ضبط المسبار والحل يتطلب خطوات متعددة ، بعضها معقد للغاية.

مع ذروة قوة q و m والبرامج الآلية ، أصبحت العديد من هذه الخطوات أكثر بساطة ، مما يجعل العملية أسهل بكثير للمستخدمين الجدد والطلاب الجامعيين. سيظهر هذا الإجراء ثلاثة طلاب جامعيين من مختبري البحثي ، ماري كروجر وبلير سورنسون وجيسيكا توماس. سيتابع هؤلاء الطلاب دراساتهم العليا في مجالات علم الأحياء الدقيقة والهندسة الكيميائية والكيمياء في العام المقبل.

يجب تشغيل هذه العناصر بترتيب معين. أولا ، الكمبيوتر ، ثم وحدة التحكم ، وأخيرا ، ضوء الألياف البصرية. يحتاج المجهر إلى قراءة FM و LF fm.

يجب أن تكون الكاميرا متمركزة فوق رأس FM البصري في البرنامج. يجب تحديد ما يلي. فئة التجربة هي الخواص الميكانيكية.

مجموعة التجربة هي رسم الخرائط الميكانيكية النانوية الكمي ، والتجربة هي ذروة القوة q و m في السائل. مع تحديد الإعدادات بشكل صحيح ، يمكن تحميل التجربة وإعدادها. يجب ضبط تركيز الكاميرا باستخدام الهدف Z أولا ، متبوعا باستخدام عناصر التحكم في الدورة التدريبية لوضع المرحلة ، والهدف هو وضع فتحة رأس A FM ملليمتر واحد قبل سطح المسرح لمعالجة أقراص العينة باستخدام الميكا المشقوقة حديثا تحتوي على ملاقط دائرية على القابض القرصي.

ابدأ بتجميع خلية السائل من الأجزاء التي تم تنظيفها بشكل أصلي. أولا ، قم بتوصيل محول الخرطوم بالمنفذ الموجود على خلايا السوائل النظيفة. ثم باستخدام ملاقط مسطحة الرأس برفق شديد ، اضغط على الحلقة O في المسافة البادئة على الخلية السائلة.

بعد ذلك في مشبك تثبيت المسبار ، اضغط على الزنبرك برفق وأبعده عن الأخدود. باستخدام نفس الملقط ، أمسك المسبار وحركه في الأخدود ، بحيث يواجه الطرف مركز الخلية. ثم قم بتأمين المسبار باستخدام المقطع.

الخطوة التالية هي التحقق من أن المشبك الموجود على FM.It A يجب سحبه بالكامل. ضع المجموعة متجها لأسفل أعلى العينة. قم بتركيب المجموعة على ترصيع A FM لتحقيق الاستقرار.

اخفض المشبك. لفحص الحلقة O ، اضغط على المفتاح السفلي على المجهر حتى تظهر الحلقة O. يجب ضغطه بإحكام بين قرص الدعم وخلية السائل.

يمكن التركيز على خلية السائل باستخدام مقبض الضبط الخشن. بعد ذلك ، باستخدام ضبط XY ، ركز على طرف المسبار. يبدو وكأنه مثلث ذهبي معدني.

الآن باستخدام ذراع البيزو السفلي ، حرك الطرف بالقرب من سطح العينة ، واضبط التركيز على الأطراف ، والانعكاس ، وراقب موضع الكابولي فيما يتعلق بهذا الانعكاس. في الوقت الحاضر ، يجب أن تكون متسافئة بشكل وثيق ولكن لا تتداخل تماما. الآن ، قم بإعداد المحقنة.

املأه بملليلتر واحد من محلول المخزن المؤقت وقم بتوصيل المحول. ثم قم بتوصيل المحقنة بخرطوم الطرد وقم بتمديد المكبس بالكامل. بعد ذلك ، قم بتوصيل الخرطوم بخلية السائل باستخدام محول لملء الغرفة ، واضغط برفق على المكبس حتى يمتلئ مركز الغرفة.

يجب ألا يكون هناك أي فقاعات هواء أو انسكاب من خلية السائل على المجهر. ثم ضع المحقنة في وضع مدعوم جيدا فوق الغرفة. بعد ذلك ، استخدم موجز الكاميرا ومقابض الترجمة XY.

لتحديد موقع الليزر على الشاشة ، يجب أن يظهر كنقطة حمراء منتشرة. بمجرد تحديد موقعه ، استخدم أدوات التحكم بالليزر لنقله إلى المسبار. الآن أخيرا ، اضبط عناصر التحكم في الليزر والمرآة حتى يتم تكبير إشارة المجموع على المجهر إلى ما بين أربعة وستة ، واضبط الصمام الثنائي الربعي.

بعد ذلك ، استخدم المقابض الموجودة على رأس المسح لضبط الانحرافات الرأسية والأفقية حتى تعود القيم الموجودة على المجهر إلى أقرب ما يمكن من الصفر. تأكد من تحديد خيارات الاستحواذ المناسبة قبل المتابعة. اضبط معدل المسح الضوئي على حوالي هرتز واحد في نافذة العينات لكل سطر.

أدخل 256. للمساعدة في المسح الضوئي التحكم التلقائي. حدد فردا لإيقاف تشغيل حد Z التلقائي لمساعد المسح الضوئي.

يجب أن يكون حد Z 500 نانومتر ، ويجب أن يكون حجم المسح ميكرون واحد. مع ضبط الإعدادات بشكل صحيح ، قم بقياس المسبار. لاحظ تغير جهد Z pazo عندما يقترب طرف المسبار من السطح.

إذا خرج الطرف عن النطاق ، انسحب واقترب ، فقد يتعين استبدال طرف المسبار. إذا لم يفلح ذلك، فعند تعشيق التلميح، يجب أن تظهر الخطوط على كل نافذة من نوافذ الاكتساب وستقوم هذه الخطوط بإنشاء صورة. ابدأ في التقاط صور الميكا باستمرار.

قم بالتكبير ببطء للتأكد من أن سطح MICA مسطح ونظيف. قم بإعداد طبق بتري من أربع غرف مع محلول عازل للتصوير المبرد. تحتاج كل غرفة إلى خمسة ملليلتر على الأقل.

قبل تناول كمية من البروتين المخفف ، حركه برفق باستخدام الماصة الدقيقة. ثم خذ 200 ميكرولتر من الكمية وقم بتطبيق البروتين المخفف على سطح MICA. انتظر حوالي 30 ثانية حتى يستقر المحلول على السطح.

ثم باستخدام قابضي القرص ، ارفع القرص دون إمالته واغمره على الفور في المجموعة الأولى من محلول المخزن المؤقت. لمدة ثانية واحدة ، تأكد من بقاء القرص موازيا للمقعد. من المهم جدا إبقاء العينة موازية لطبق بتري أثناء خطوة الشطف.

يمكن تشويه هذه الجزيئات الناعمة والمرنة على السطح بواسطة تيارات قوية من المحلول المائي. بعد ذلك ، اغمر القرص لفترة وجيزة في كل من التجمعات الثلاثة الأخرى لمدة ثانية واحدة لكل مسبح. ثم انقل القرص إلى قطعة قماش جافة وخالية من الغبار.

دع الرطوبة الزائدة تنتقل إلى قطعة القماش ، لكن لا تدع القرص يجف تماما. لا تسمح لقطعة القماش بلمس العينة قم بإزالة العينة بعناية من قطعة القماش باستخدام قابضي القرص وضع العينة على الماسح الضوئي A FM. ضع الخلية السائلة أعلى العينة وتابع الإعداد والتصوير.

بعد كل معلمات المسبار ، يتم ضبط حجم الزنبرك ونصف قطر الطرف بشكل صحيح. قم بقياس المسبار كما هو الحال عند التصوير. ميكا, لاحظ ZP azo عندما يقترب الطرف من السطح.

عند التقاط الصور ، اسمح للماسح الضوئي بتصوير نفس المنطقة لتمريرتين متتاليتين على الأقل. استخدم الالتقاط المستمر لحفظ كل صورة. اضبط حجم الصورة وموقعها حسب الرغبة.

بمجرد انتهاء البرنامج الآلي من ضبط معلمات المسح الضوئي لحجم صورة معين. قم بإيقاف تشغيل البرنامج بشكل جيد. ضبط تركيز الصورة يدويا ، واضبط معدل المسح ، وحد Z ، وعدد الأسطر ، ونقطة الضبط.

إذا أصبحت الصورة غير مركزة للغاية، فقم بتشغيل البرنامج مرة أخرى للعودة إلى موضع البداية الأصلي. أثناء تكبير البروتين ، قلل معدل المسح وقم بزيادة عدد الأسطر بشكل متناسب من أجل زيادة دقة الصورة. فيما بعد. عند تحليل الصور ، أولا ، قم بتسطيح الصورة بالنقر فوق أيقونة التسوية.

حدد الأمر الصفري وقم بتنفيذ العملية. في بعض الأحيان يكون من الضروري استخدام ملاءمة بسيطة للحصول على صور مسطحة بشكل مناسب. حدد أيقونة الملاءمة العادية واستخدم المؤشر لرسم مستوى فوق منطقة مسطحة في الصورة.

قم بتنفيذ الملاءمة العادية وكرر العملية حسب الضرورة. بعد ذلك ، حدد علامة تبويب المقطع العرضي لقياس أبعاد البروتين. ارسم خطا بالمؤشر فوق الجزيء أو المنطقة المراد تحليلها.

كرر هذه العملية في مجالات متعددة. إذا كان التراكب مطلوبا ، فيمكن دراسة أي عدد من الجزيئات البيولوجية باستخدام FM لبروتين مستقبلات ضوئية في حالته المتكيفة مع الضوء ، وركيزة الميكا المشقوقة حديثا هي سطح مستو مناسب لامتصاص البروتين. يمكن ملاحظة ثنائيات البروتين المستقبلة الضوئية المفردة باستخدام وضع QNM لقوة الذروة.

تشير الأسهم إلى ثنائيات فردية وتشير العلامة النجمية إلى مجموع البروتين باستخدام برنامج تحليل الصور. يمكن قياس المقاطع العرضية للبروتينات بعد تسطيح الصورة. ترتبط بيانات XY بقياسات الارتفاع.

يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من العمليات الحسابية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إعداد تجربة A FM لجمع صور عالية الدقة للبروتينات على سطح في بيئة ذات صلة بيولوجيا. باستخدام قوة الذروة q و m بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات تقريبا.

لذلك ، فإن ذروة القوة q و m هي شكل مناسب من أشكال الفحص المجهري للقوة الذرية لتقديمها للطلاب الجامعيين المسجلين في دورات معملية مثل التحليل الآلي والكيمياء الحيوية والفيزياء الحديثة. بعد تطويرها ، تمهد هذه الطريقة الطريق للباحثين في مجال الفحص المجهري للمسبار لاستكشاف الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات والأحماض النووية وحتى الخلايا الحية في الوسائط ذات الصلة بيولوجيا.