Name: قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: تعلم قياس الاستجابة التغذية في حيدرة باستخدام الجلوتاثيون المختزل. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة آليات التغذية والشعور الكيميائي في الكائنات البحرية البسيطة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يعرب المؤلفون عن امتنانهم ل K.P. Madhu و Nita Beliappa وموظفي المركز الإعلامي للمعهد الهندي لتعليم العلوم والبحث ، بيون لمساعدتهم في إنتاج الفيديو. تم دعم العمل بتمويل في إطار برنامج مركز التميز التابع لقسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند إلى SG وزمالة ما بعد الدكتوراه من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، حكومة الهند إلى RK.

1. هيدرا الثقافة وقياس الاستجابة التغذية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الاورام الحميدة هيدرا في الثقافة عن طريق تغذية لهم يوميا مع الأرتيميا وابقائها في المتوسط ​​(1 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة، ودرجة الحموضة 7.6، 1 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم CaCl 2، 0.1 ملم بوكل، و 0.1 ملي MgSO 4) الواردة في زجاج وعاء عند 18 درجة مئوية تحت 12 ساعة ضوء لمدة 12 ساعة دورات مظلمة كما هو موضح سابقا (12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس استجابة للتغذية، ونقل احد تنضج سليلة هيدرا وجود بين 5 و 6 مخالب لبئر واحد من 24 لوحة جيدا. إزالة المتوسطة المتبقية من البئر عن طريق إمالة، ثم تضاف على الفور 500 ميكرولتر من متوسطة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 9 ميكرومتر حل الجلوتاثيون في المتوسط ​​حيدرة. منذ حل الجلوتاثيون هو عرضة للأكسدة، استخدم دائما حل الجلوتاثيون الطازجة لكل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة لمنصة التصوير من المجهر وجود أحكام لتسجيل الصورة. استخدام خلفية داكنة تلك التي س السلوكو سليلة هيدرا يمكن تصويرها بشكل واضح على خلفية المتناقضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرفة تستخدم للمراقبة والتصوير سلوك هيدرا خالية من الأضواء من تذبذب شدة، وتيارات الهواء والضوضاء. يمكن لهذه الاضطرابات أيضا أن يسبب ورم هيدرا لتظهر انكماش مخالب - حتى في حالة عدم وجود الجلوتاثيون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للورم للاسترخاء لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن ورم يقع على طول المنطقة الوسطى من مثل جيدا أن السلوك يمكن تصويرها بشكل واضح. إذا كانت سليلة هو على حافة البئر، وإحضاره إلى المركز من قبل بيغ المتوسطة باستخدام ماصة والسماح لها مرة أخرى للاسترخاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة من هيدرا في حالة استرخاء. وستكون هذه الملاحظة نقطة الصفر مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إضافة 9 ميكرومتر حل الجلوتاثيون للوصول إلى تركيز النهائي من 3 ميكرومتر في البئر. اعتمادا على الغرض من التجربة والرد الذي أبداه هيدرا، واختبار مجموعة من تركيزات مختلفة من الجلوتاثيون وتشوحد ذاته تركيز مناسب المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الموقت فورا بعد إضافة حل الجلوتاثيون والتقاط الصور بعد كل 15-30 ثانية لمدة 4-5 دقيقة. لا تغيير إعدادات التكبير خلال الوقت الفاصل بين التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول الجلوتاثيون بلطف ومع تدفق موحد من هذا القبيل أن موقف الحيوان في البئر سوف تضطرب طفيفة في مجال الرؤية من المجهر. ومع ذلك، إذا يتحرك سليلة على نطاق واسع بعد إضافة حل الجلوتاثيون، حرك لوحة بلطف جدا لجلب ورم في مجال الرؤية لالتقاط الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تجربة السيطرة، واستخدام تفتقر المتوسطة الجلوتاثيون مع الحفاظ على جميع المعلمات أخرى مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من تنفيذ كافة الخطوات التجريبية السابقة خلال النصف الأول من اليوم - قبل 13:00 لتجنب التأثير المحتمل لإيقاع الساعة البيولوجية على مدى استجابة التغذية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح كل واحدة من الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج التلاعب جنو صورة (الأعرج). استخدام "القياس" وسيلة متاحة من القائمة&gt; الأدوات&gt; قياس لتحديد المسافة بين نهاية قمية كل من مخالب والكارح. إذا لاحظت فتحة الفم في أي من الصور، وتحديد المسافة بين وسط الفم وافتتح نهاية قمية من اللامسة. الرجوع إلى هذه المسافة مع انتشار اللامسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب معدل انتشار اللامسة لكل ورم قبل وبعد التعرض الجلوتاثيون. حساب متوسط ​​نسبة انتشار اللامسة عند نقطة الصفر مرة لأنه في كل لاحقة نقاط الوقت. وسوف يطلق هذا نسبة انتشار اللامسة النسبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار القياسات لا يقل عن 20 البوليبات. </li></ol><img alt="المعادلة 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400"> <img alt="المعادلة 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450"> 2. طريقة التحقق من صحة استخدامالمجاعة نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمجاعة، ونقل بعض الاورام الحميدة هيدرا إلى وعاء زجاجي منفصل ولا إطعامهم لمدة 5 أيام. إطعام مجموعة مراقبة من بضعة الاورام الحميدة يوميا مع الأرتيميا في وعاء مماثل الحجم. تغيير المتوسطة من كلا التجريبية الأوعية يوميا لتجنب نمو الفطريات في المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التجربة، وإطعام مجموعة مراقبة من هيدرا مع الأرتيميا لمدة 1 ساعة واستخدام هذه هيدرا لتجارب لاحقة بعد إزالة جميع الأرتيميا غير مأكول وميت من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس استجابة للتغذية هيدرا تجويع بالمقارنة مع هيدرا من المجموعة الضابطة التي كتبها الطريقة الموضحة في الخطوة 1. في وقت سابق لتفادي أي تحيز بسبب وقت الرصد، بالتناوب قياسات كل من تجويع الاورام الحميدة والسيطرة هيدرا. </li></ol>

<ol><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+control+of+the+specific+feeding+reactions+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Ny.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra.</a> Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).</li>
<li>Beckmann, A., Ozbek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nematocyst%3A+a+molecular+map+of+the+Cnidarian+stinging+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle.</a> Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).</li>
<li>Venturini, G., Carolei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+receptors+in+Hydra.+Pharmacological+and+biochemical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).</li>
<li>Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+and+GABAnergic+control+in+the+tentacle+effector+systems+of+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris.</a> Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+GABA+and+glycine+in+the+modulation+of+chemosensory+responses+in+Hydra+vulgaris+%28Cnidaria%2C+Hydrozoa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiology%22%5BJournal%5D)">Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa).</a> Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+NMDA+receptors+in+Hydra%3A+a+biochemical+and+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study.</a> Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).</li>
<li>Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allatotropin%3A+An+ancestral+myotropic+neuropeptide+involved+in+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+Hydra+glutathione+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins.</a> FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).</li>
<li>Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Glutathione+in+the+Nervous+System%22">Glutathione in the Nervous System</a>. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).</li>
<li>Venturini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydra+GSH+receptor.+Pharmacological+and+radioligand+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).</li>
<li>Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+and+phylogenetic+characterization+of+common+hydra+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Description and phylogenetic characterization of common hydra from India.</a> Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).</li>
<li>Horibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+catabolic+pathway+of+glycosphingolipids+in+a+hydrozoan%2C+Hydra+magnipapillata.+Involving+endoglycoceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase.</a> J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).</li>
<li>Koizumi, O., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rise+of+feeding+threshold+in+satiated+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rise of feeding threshold in satiated Hydra.</a> J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).</li>
<li>Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+and+detergent+solubilization+of+the+putative+glutathione+chemoreceptor+from+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra.</a> Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).</li>
<li>Morita, H., Hanai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+receptor+proteins+in+invertebrates+-+with+special+reference+to+glutathione+receptor+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra.</a> Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).</li>
<li>Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+involvement+in+Hydra+vulgaris+very+primitive+olfactory-+like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system.</a> Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).</li>
<li>Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+homologous+subunits+form+a+high+affinity+peptide-gated+ion+channel+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra.</a> J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).</li>
<li>Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+family+C+G-protein-coupled+receptors+by+the+tripeptide+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione.</a> J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).</li>
<li>Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+in+hydra+is+modulated+by+glycine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).</li>
<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

سلوك التغذية في حيدرة يمثل واحدا من أكثر أنظمة حسي كيميائي الأجداد في metazoans. على الرغم من أن تم الكشف عن وجود الجلوتاثيون في السائل القشريات صدر بعد بمساعدة كيسة خيطية التقاط الفريسة منذ فترة طويلة 1، وقد تميزت أيا من البروتين GSHR ولا المفترض الجين الترميز / ث من هيدرا حتى الآن. وقد بذلت محاولات قليلة لوصف GSH البروتينات ملزمة في هيدرا 8 و 14 و 15. ومع ذلك، فإن هوية هذه البروتينات المستقبلة المفترضة تبقى المكونات الجزيئية الأخرى غامضة وقليلة جدا، والتي م...

Hydra هو الكائن الحي الأكثر بدائية الذي يمتلك جهازا عصبيا وإحساسا كيميائيا للكشف عن انخفاض الجلوتاثيون (GSH) لالتقاط الفريسة1. يتغذى على مجموعة متنوعة من مثل الديدان الخيطية والقشريات ويرقات الحشرات والضفادع الصغيرة والأسماك حديثةالفقس 1. تتسبب حركة هذه الكائنات الحية المفترسة في إفرازات حسية ميكانيكية للكبسولات اللاذعة التي تسمى الكيسات الخيطية من الهيدرا ، والتي يتم إدخالها في الفريسة2. يعمل GSH الموجود في السائل المنطلق من الفريسة المصابة لاحقا على تنشيط استجابة التغذية في الهيدرا والتي تشمل تجعيد المجسات لجلب الفريسة نحو الفم ، وفتح الفم ، وما يترتب على ذلك من ابتلاع الفريسة. ثبت أن الجزيئات المتعددة ، مثل الدوبامين3 ، والغلوتامات4 ، و GABA ،والجلايسين 5 ، ومستقبلات NMDA6 ، و allatotropin7 ، متورطة في استجابة التغذية في الهيدرا. لقد ثبت أيضا أن الاستجابة الحسية الكيميائية التي يسببها GSH يتم تعديلها من خلال حالة تغذية بحيث أظهرت الهيدرا الجائعة استجابة تغذية محسنة1. هذه الزيادة في حساسية GSH ذات صلة بيولوجيا لأنه تحت الجوع تحتاج هيدرا إلى العثور على فريسته بحساسية أعلى. 
 على الرغم من أنه يمكن ملاحظة استجابة التغذية الناتجة عن GSH بوضوح تحت المجهر ، إلا أن الطرق المستخدمة عادة لقياس ملاحظات استجابة التغذية غير كمية. في معظم الحالات, تم أخذ الوقت الذي يظل فيه فم الهيدرا مفتوحا كمقياس لاستجابة التغذية8,9; بينما في حالة أخرى ، استند القياس الكمي إلى عدد الهيدرا من بين السكان الذين أظهروا استجابة التغذية10. ومع ذلك ، فإن مراقبة وقت فتح الفم لسلائل هيدرا أمر مرهق وعرضة للتباين الناجم عن معلمات لا يمكن السيطرة عليها مثل اتجاه اتجاه الفم أثناء الملاحظات. وبالمثل ، نظرا لأن استجابة التغذية هي معلمة كمية ، فإن الأساليب القائمة على السكان تخضع للاختلافات / الأخطاء الناجمة عن الرأي أو التحيز الرصدي للمراقب الفردي. للتحايل على هذه المشكلات ، قمنا بتطوير طريقة للقياس الكمي النسبي لاستجابة التغذية في هيدرا (Hydra vulgaris Ind-Pune 11) بناء على مسافة الطرف القمي للمخالب من فم سليلة هيدرا.

<table><tbody><tr><td>حاضنة مبردة</td><td>باناسونيك&nbsp;</td><td>MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td>مجهر</td><td>لايكا</td><td>S8AP0 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>كاميرا للمجهر</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>الجلوتاثيون المخفض</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>المخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية أحضر الزجاجة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الفتح لتجنب الأكسدة</td></tr><tr><td>برنامج تحرير الصور</td><td>GIMP</td><td>الإصدار 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra هي من بين الكائنات الحية الأكثر بدائية التي تمتلك جهازا عصبيا وإحساسا كيميائيا للكشف عن انخفاض الجلوتاثيون (GSH) للقبض على الفريسة. تتسبب حركة الكائنات الحية المفترسة في إفرازات حسية ميكانيكية للخلايا اللاذعة التي تسمى الكيسات الخيطية من الهيدرا ، والتي يتم إدخالها في الفريسة. يتم تشغيل استجابة التغذية في هيدرا ، والتي تشمل تجعيد المجسات لجلب الفريسة نحو الفم ، وفتح الفم وما يترتب على ذلك من ابتلاع الفريسة ، عن طريق GSH الموجود في السائل المنبعث من الفريسة المصابة. لتكون قادرا على تحديد الآلية الجزيئية لاستجابة التغذية في هيدرا غير المعروفة حتى الآن ، من الضروري إنشاء اختبار لقياس استجابة التغذية. هنا ، نصف طريقة بسيطة لقياس كمية استجابة التغذية حيث يتم قياس المسافة بين الطرف القمي للمخالب وفم الهيدرا ويتم تحديد نسبة هذه المسافة قبل وبعد إضافة GSH. تم العثور على النسبة ، التي تسمى انتشار المجسات النسبي ، لإعطاء مقياس لاستجابة التغذية. تم التحقق من صحة هذا الاختبار باستخدام نموذج الجوع الذي تظهر فيه الهيدرا الجائعة استجابة تغذية محسنة مقارنة بالتغذية اليومية للهيدرا.

يسبب الجلوتاثيون هيدرا لتظهر الشباك من مخالب نحو الفم لغرض تجتاح فريسة. مثل هذا الشباك من مخالب يجلب نهايات قمية من مخالب أقرب إلى الكارح. هذا يؤدي إلى انخفاض في انتشار اللامسة، أو المسافة الخطية بين نهاية قمية من اللامسة والكارح (الشكل 1). انتشار اللامسة النسبي، أو نسبة متوسط ​​اللامسة انتشر قبل وبعد إضافة الجلوتاثيون، بلغ متوسط ​​عبر الاورام الحميدة متعددة يقلل بمرور الوقت. انتشار اللامسة النسبي بعد إضافة وسيلة تفتقر الجلوتاثيون، ومع ذلك، يقلل بشكل عابر فقط ويبل...

هنا نصف فحصا بسيطا لقياس استجابة التغذية في الهيدرا الناجم عن الشكل المنخفض للجلوتاثيون. يعتمد هذا الاختبار على قياس المسافة بين الطرف القمي للمخالب وفم الهيدرا.

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

في هذا الفيديو ، نصف طريقة لقياس سلوك التغذية في هيدرا. استجابة لانخفاض شكل الجلوتاثيون ، تتغذى هيدرا على مجموعة متنوعة من والديدان الخيطية والقشرة والأسماك حديثة الفقس. على الطبقة الخارجية لهذا المكون من طبقتين ، توجد خلايا متخصصة تسمى الأكياس الخيطية.تحتوي الأكياس الخيطية على محفزات ، والتي عند تنشيطها عن طريق حركة الفريسة في السائل المحيط تسبب تصريف خيوط التوتير. يتم إدخال الخيوط اللاذعة في الفريسة. تطلق الفريسة المصابة غلة الجلوكوز.يحتوي Ion hydro على إحساس كيميائي للكشف عن الجلوتاثيون في السائل المحيط. يؤدي هذا إلى سلوك التغذية الذي يشمل جهازه العصبي. يتضمن سلوك التغذية في Hydra تجعيد المجسات لجلب الفريسة نحو فرط المنظار ، وفتح الفم ، وابتلاع الفريسة.في الواقع ، تؤدي إضافة تخمة أيون المناطق المحيطة إلى تفاعل التغذية في هيدرا ، حتى في حالة عدم وجود فريسة. لفهم التفاعل بين الإحساس الكيميائي والجهاز العصبي ، نحتاج إلى تحديد السلوك وإنشاء مقاييس دقيقة ويمكن الاعتماد عليها. في عدد قليل من التقارير السابقة ، يتم أخذ الوقت الذي يظل فيه الفم مفتوحا كمقياس لاستجابة التغذية ، لكن مراقبة مدة فتح الفم في الاورام الحميدة المائية أمر شاق ويخضع للتباين الناجم عن معلمات لا يمكن السيطرة عليها مثل اتجاه الفم بسبب الملاحظات.تعتمد طريقة أخرى للقياس الكمي للسلوك على عدد الهيدرا في مجموعة سكانية تظهر استجابة التغذية. ومع ذلك ، نظرا لأن استجابة التغذية هي معلمة كمية فردية ، فإن الأساليب القائمة على السكان هي اختلافات ذاتية ناتجة عن رأي المراقب الفردي. المزايا الرئيسية للطريقة البديلة التي نصفها هنا هي أنها سهلة التنفيذ وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة.حافظ على هيدرا عند 18 درجة مئوية تحت ضوء 12 ساعة. 12 ساعة دورات مظلمة في وسط تحتوي على وعاء زجاجي وإطعامها يوميا بالدم لقياس استجابة التغذية. انقل سليلة مائية ناضجة إلى بئر من صفيحة 24 بئرا ، وقم بإزالة الوسط المتبقي من البئر باستخدام محور.يتم تسهيل ذلك عن طريق إمالة اللوحة ، والتخلص من الوسط الزائد ، ثم إضافة 500 ميكرولتر على الفور من الوسط الطازج تحضير محلول الجلوتاثيون. يتم تحضير محلول تسعة ميكرومولار من الجلوتاثيون باستخدام وسط مائي. تذكر أن محلول الجلوتاثيون عرضة للأكسدة ، لذلك استخدم دائما محلول الجلوتاثيون الطازج.لكل تجربة ، انقل اللوحة إلى منصة التصوير بالمجهر. عند توفير تسجيل الصور ، استخدم خلفية داكنة بحيث يمكن تصوير سلوك الاورام الحميدة المائية بوضوح على الخلفية المتناقضة. تأكد من أن الورم الحميد يقع على طول الجزء المركزي من البئر الذي تم التقاطه صورة هيدرا في حالة الاسترخاء.ستكون هذه ملاحظة نقطة زمنية صفر. أضف بسرعة تسعة محلول جلوتاثيون ميكرومولار للوصول إلى التركيز النهائي لثلاثة ميكرومولار في البئر. ابدأ المؤقت مباشرة بعد إضافة محلول الجلوتاثيون والتقط الصور بعد كل 15 أو 30 ثانية لمدة أربع إلى خمس دقائق دون تغيير إعدادات التكبير.بالنسبة للقياسات ، نستخدم الإصدار الثاني من gim ، gim. برنامج معالجة صور جنو هو برنامج يمكن تنزيله مجانا من الإنترنت. افتح كل صورة من الصور الملتقطة في gim.يحتوي هذا البرنامج على أداة قياس متاحة من أدوات القائمة. يمكن قياس المسافة بين فرط الفغرة والنهاية القمية لكل من المجسات باستخدام هذه الأداة. هذه المسافة تسمى انتشار المجالب.احسب متوسط انتشار المجسات لكل ورم قبل وبعد الجلوتاثيون. احسب نسبة متوسط انتشار المجسات في وقت الصفر. أشر إلى ذلك في كل نقطة من النقاط الزمنية اللاحقة.دعونا نسمي هذا انتشار المجسات النسبي. قم بإجراء هذه القياسات لما لا يقل عن 20 سليلة للجوع. انقل بعض السلائل المائية إلى وعاء زجاجي منفصل ولا تطعمها لمدة خمسة أيام.قم بإطعام الاورام الحميدة الضابطة يوميا بالأرتيا في يوم التجربة. قم بإطعام المجموعة الضابطة من Hydra ب artia لواحد R واستخدم هذه الهيدرا للتجارب اللاحقة. قم بقياس استجابة التغذية للهيدرا الجائعة مقارنة بالهيدرا من مجموعة التحكم بالطريقة الموضحة سابقا في هذا الفيديو لتجنب أي تحيز بسبب الوقت البديل ، قياسات كل من الاورام الحميدة المائية الجائعة والمتحكم فيها.يتسبب الجلوتاثيون في ظهور تجعد مخالب الهيدرا باتجاه الفم. مثل هذا الشباك يجعل النهايات القمية للمخالب أقرب إلى العاصفة المنخفضة. ينتج عن هذا انخفاض في المسافة الخطية بين الأطراف القمية للمخالب وانتشار العاصفة المفرطة أو المجالب.انتشرت المجسات النسبية بعد إضافة الوسط. نقص الجلوتاثيون يقلل بشكل عابر فقط. ترتد إلى واحدة في حوالي دقيقة.من المعروف أن الجوع يسبب تعزيز سلوك التغذية الناجم عن الجلوتاثيون. كانت اللامسة المنتشرة بعد دقيقة واحدة من إضافة الجلوتاثيون أقل بكثير لمجموعة الموظفين مقارنة بالمجموعة المشبعة. تستخدم جميع الإحساس الكيميائي للكشف عن الطعام.يستخدم هيدرا إشارة كيميائية في شكل جلوتاثيون يتم إطلاقه من الفريسة المصابة ، وله جهاز عصبي بسيط بدون أي بنية شبيهة بالدماغ ، لذلك من المحتمل أيضا أن تكون الآلية الجزيئية للإحساس الكيميائي والتعديل المعتمد على حالة التغذية بسيطة. قد يلقي فهم هذه الآلية الضوء على تطور تنظيم التغذية في العليا. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن المستقبل الذي يمكنه ربط الجلوتاثيون أو أي مكونات أخرى لسلسلة الإشارات النهائية في هايدا حتى هذا التاريخ.يمكن أن تثبت المثبطات الدوائية للكيماويات الشائعة ومسارات الإشارات الحسية واستخدام التقنيات البيولوجية الجزيئية المتقدمة لتغيير التعبير عن بروتينات الإشارات ومستقبلات الجلوتاثيون أنها أدوات قوية لفهم الآلية الجزيئية للتغذية. ومع ذلك ، في هيدرا ، هناك حاجة إلى مقياس موثوق به لسلوك التغذية المتغير لفهم مدى أي تعديلات ناجمة عن مثل هذه التحقيقات التجريبية. لقد قدمنا هنا طريقة ليست موثوقة فحسب ، بل سهلة الأداء أيضا وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة.

measuring-glutathione-induced-feeding-response-in-hydra

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم التأثيرات السامة للأعصاب للجسيمات النانوية باستخدام الخلايا الدبقية الصغيرة. يحدد خطوات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بالجسيمات النانوية ، وتصفية الوسائط المشروطة لعزل السيتوكينات المؤيدة للالتهابات المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة ، واختبار سمية الخلايا العصبية تحت المهاد باستخدام الوسائط المكيفة.

تحديد السمية التي يسببها الجسيمات النانوية في الخلايا العصبية التي تستخدم الخلايا الدبقية الصغيرة كجهاز استشعار حيوي بديل

هذه المادة سوف تظهر كيفية رصد ديناميات الجلوتامين في الخلايا الحية باستخدام الحنق. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية وسوف تناقش لأجهزة الاستشعار الجلوتامين المشفرة وراثيا.

الجلوتامين الجريان التصوير باستخدام مجسات مشفرة وراثيا

من خلال علاج مزدوج مع الكولشيسين، السموم المشتقة من النبات الذي يقتل الخلايا الانقسام، يمكن أن تتولد هيدرا فولغاريس الخالية من الأعصاب. هذه هيدرا لا يمكن تغذية أو إيستست من تلقاء نفسها. وتصف هذه الورقة طريقة محسنة للصيانة طويلة الأمد لل هيدرا فولغاريس العصبية الحرة في المختبر.

توليد وصيانة طويلة الأجل خالية من الأعصاب<em&gt; حيدرة</em

توفير فحوصات تناول الطعام الكمية مع الأغذية المصبوغة قوية والفائق يعني تقييم الدافع التغذية. الجمع بين تحليل استهلاك الغذاء مع ثيرموجينيتيك وشاشات أوبتوجينيتيك نهج قوية للتحقيق في الدوائر العصبية الكامنة وراء الشهية في تعليم الكبار melanogaster المورفولوجية.

الجمع بين تناول الطعام الكمية فحوصات وتنشيط الخلايا العصبية لدراسة الشهية في المورفولوجية قسراً

هذه المخطوطة يصف استخدام الصحفيين فلوروجينيك ترميز وراثيا في تطبيق التصوير خلية يعيش لدراسة الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. ويوفر هذا النهج التجريبي القرار الزمانية المكانية لم يسبق لها مثيل، وحساسية، وخصوصية مع تجنب العديد من أوجه قصور الأساليب التقليدية المستخدمة للكشف عن الأكسدة السمية.

التصوير النهج لإجراء تقييمات للسمية الأكسدة باستخدام أجهزة استشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا

تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات الغلوتامات (GluR) الاتجار في الثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة. باستخدام نهج تغذية الأجسام المضادة لتسمية مستقبلات ذاتية أو مبالغ فيها في تركيبة مع النهج الدوائية، وهذا الأسلوب يسمح لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم التعبير سطح غلور عن طريق تحوير عمليات الاستيعاب الداخلي أو إعادة التدوير.

نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة

الموصوف هنا هو بروتوكول يمكن من القياس الكمي اللوني لكمية الطعام التي تؤكل في غضون فترة زمنية محددة من قبل يرقات Drosophila melanogaster المعرضة لأنظمة غذائية ذات جودة مختلفة من المغذيات الكبيرة. يتم إجراء هذه المقايسات في سياق شاشة عصبية حرارية.

القياس الكمي لمدون المغذيات الكبيرة في شاشة عصبية حرارية جينية باستخدام يرقات دروسوفيلا

توضح هذه المقالة بروتوكول لتحديد الاختلافات في حالة الأكسدة القاعدية واستجابات الأكسدة الحمراء للاضطرابات الحادة في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر والقشرية باستخدام المجهر الحي confocal. يمكن تطبيق البروتوكول على أنواع الخلايا الأخرى والمجاهر مع الحد الأدنى من التعديلات.

التصوير الحي لحالة الميتوكوندريا الجلوتاثيون ريدوكسي في الخلايا العصبية الأولية باستخدام مؤشر قياس النسب

تم تحقيق القياس الكمي لكل من الأشكال المؤكسدة والمخفضة من الجلوتاثيون (GSSG و GSH ، على التوالي) من خلال استخدام أورثو فثالدهيد (OPA). يصبح OPA شديد الفلورسنت بمجرد اقترانه ب GSH ولكنه غير قادر على اقتران GSSG حتى يتم تقليله. هنا ، نصف مقايسة متعددة المعلمات لتحديد كليهما باستخدام القياس الكمي للبروتين للتطبيع.

القياس الكمي السريع للأشكال المؤكسدة والمخفضة من الجلوتاثيون باستخدام أورثو فثالدهيد في خلايا الثدييات المستزرعة في المختبر

يصف هذا البروتوكول مقايسة لتحديد معدل تغذية Caenorhabditis elegans بناء على قياس إزالة البكتيريا في الثقافة السائلة.

قياس كمية الطعام في Caenorhabditis elegans عن طريق قياس التخليص البكتيري

باستخدام التصوير المؤقت الزائد، يمكن متابعة عملية التجدد الكاملة لكرويدات هيدرا . يصف هذا البروتوكول توليد كرويدات هيدرا ، ويناقش مجموعة متنوعة من استراتيجيات التثبيت، ويشرح كيفية إجراء التصوير الحي طويل الأمد باستخدام المجهر الكونفوكالي الدوار على الأقراص الدوار بالإضافة إلى المجهر الفلوري الصفائح الضوئية.

التحضير والتصوير الحي لكرويدات هيدرا المتجددة

تعلم قياس الاستجابة التغذية في حيدرة باستخدام الجلوتاثيون المختزل. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة آليات التغذية والشعور الكيميائي في الكائنات البحرية البسيطة.

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

استكشف المزيد من الفيديوهات