إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل في المختبر فحوصات تكون الميالين

الهدف العام من هذا الإجراء هو التلاعب الفيروسي بالخلايا السليفة قليلة التغصن أو OPCs للتعبير عن البروتينات ذات الأهمية. بالنسبة للدراسة المختبرية لأمة النخاع في الجهاز العصبي المركزي ، يتم تحقيق ذلك عن طريق استنساخ ناقل الفيروس العسسي أولا. الخطوات التالية هي إنتاج الفيروس العدسي وتحديد التركيز الفيروسي الأمثل للتجربة.

بعد ذلك ، يتم نقل OPCs المثقلة والمزروعة مع فيروس العدس. الخطوة الأخيرة هي زرع OPCs المنقولة على الخلايا العصبية المستنبتة التي تم تشريحها من DRG. في النهاية ، يتم تقييم الثقافات المشتركة للنخاع لتعبير بروتين المايلين عن طريق تحليل اللطخة الغربية وتصورها لتكوين أجزاء محورية نخاعية عن طريق التلوين المناعي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الأدوات الدوائية ، هي أن نهج الفيروسات العدسية يسمح لنا بالإفراط في التعبير بشكل انتقائي عن النوع البري أو البروتينات الطافرة في نوع الخلية المطلوب ، كما هو الحال في هذه الحالة ، الخلايا قليلة التغصن في التحضير استنساخ 2K سبعة متجهات الصوم المطلوبة كما هو موضح في بروتوكول النص في صباح يوم التعداء ، قم بإعداد 32 مليون HKE 2 93 خلية T في قارورة T 1 75 تحتوي على 25 مل من الوسائط. بشكل حاسم ، يجب أن تكون هذه الخلايا عالقة قبل التعدي ، لذا قم بوضعها في وقت أقرب إذا لزم الأمر. في أنبوب فالكون سعة 50 مليلتر ، قم بإعداد مزيج رئيسي لتعداء قارورة T 1 75 كما هو مفصل في الجدول الأول ، وأضف الحمض النووي إلى دوامة DMEM الدافئة ، ثم أضف PEI المعقم أخيرا لتجنب هطول الأمطار المبكر.

تخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب ثلاث أو أربع مرات ، ثم احتضان المزيج لمدة 15 دقيقة على المقعد. قم بتغيير الوسائط الموجودة على الخلايا ثم أضف خليط التعداد. يقوم DROPWISE بخلط الوسائط برفق فوق الخلايا ثم احتضان الخلايا طوال الليل.

في اليوم التالي. يمكن التحقق من تعبير GFP عن طريق الفحص المجهري الفلوري. بعد 48 ساعة من التعدي ، اجمع الدفعة الأولى من المادة الطافية الفيروسية وأضف 25 مل من الوسائط الطازجة إلى الخلايا.

جهاز الطرد المركزي للطافي الفيروسي عند 1 ، 140 جي ثانية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية الفيروسية بدون حبيبات بقايا الخلية إلى أنبوب جديد وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي بعد 72 ساعة من التعدي ، اجمع الدفعة الأخيرة من أجهزة الطرد الطافي الفيروسية لإزالة بقايا الخلية وتتجمع مع الدفعة الأولى من المادة الطافية الفيروسية التي تم تطهيرها.

ثم قم بتركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق للطافي الفيروسي عند 170،000 Gs لمدة 90 دقيقة. عند أربع درجات مئوية. قم بتفريغ جهاز الطرد المركزي الفائق واسكب المادة الطافية بعيدا ، تاركا حنكا من جزيرة الأمير إدوارد المترسبة والفيروس ، والذي لا يمكن رؤيته في الجزء السفلي من الأنبوب سعة 30 ملليلترا.

كرر هذه العملية. الطرد المركزي لجميع السوبر الخارفي الفيروسي على دفعات في نفس الأنابيب 30 مليلتر لتركيز الفيروس لإعادة تعليق الفيروس في كل أنبوب طرد مركزي فائق. أضف 500 ميكرولتر من وسائط Sato وقم بتغطية الأنبوب بالفيلم.

ثم قم بتدوير الأنبوب لمدة 30 ثانية وقم بإزاحة الحبيبات ميكانيكيا بطرف ماصة. كرر هذه الدورة التي تم إزاحتها من الدوامة حوالي ست مرات لضمان تعليق الحبيبات بالكامل في وسائط ساتو. الآن قم بتجميع كل الفيروس المعلق في ساتو في أنبوب صغير جديد.

بتدوير المادة الطافية المجمعة لفترة وجيزة بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة. لتكبيل PEI ، قم بجمع المادة الطافية التي تحتوي على الفيروس والتصفية عن طريق تمرير المحلول عبر مرشح 0.45 ميكرون باستخدام حقنة للتغلب. Aliquot الفيروس المنقى في Sedia إلى 2050 و 100 ميكرولتر وتخزينها جميعا عند سالب 80 درجة مئوية.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، لديك خلايا أولية سلائف قليلة التغصن. OPCs مستزرعة في لوحات 10 سنتيمترات مع 10 ملليلتر من السيديا تحتوي على عوامل النمو التالية, C-N-T-F-P-D-G-N-N NT ثلاثة, وللخلايا يجب أن تكون مستزرعة لمدة 24 ساعة تحت 8٪ ثاني أكسيد الكربون. ابدأ بشفط الوسائط وقم بإزالتها تماما.

ثم استبدلها ب 10 مل من نفس الوسائط مع عوامل النمو. تصيب OPCs الخاصة بك مع فيروس العدس, التعبير عن البروتين محل الاهتمام عن طريق إضافة الحجم المطلوب من الفيروس بالتنقيط في الوسائط. أيضا في لوحة OPC منفصلة ، امزج فيروس العدسات الضابط الذي يعبر عن GFP فقط في ثقافة الوسائط ، والخلايا لمدة 48 ساعة أخرى.

ثم جمع OPCs من لوحات للبذر على الخلايا العصبية GRG المستنبتة. اشطف كل طبق أولا بثمانية ملليلتر من EBSS مرتين. اصنع ملليلترا واحدا من التربسين EDTA 0.05٪ مع تسعة ملليلتر من EBSS الدافئ.

أضف خمسة ملليلتر من التربسين المخفف إلى كل طبق. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى دقيقتين. قم بتحييد التربسين بإضافة خمسة ملليلتر من 30٪ FBS في EBSS.

ثم باستخدام ماصة سعة 10 مل. اغسل OPCs من سطح اللوحة. اقلب اللوحة بمقدار ربع دورة في كل مرة لجمع كل الخلايا.

انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة عند 180 Gs.Now استنشق المادة الطافية وإعادة التغذية. بيليه الخلية في مليلتر من وسائط سادو الدافئة دون عوامل النمو وعد الخلايا.

بعد ذلك ، قم بإعداد الخلايا العصبية DRG التي يتم زراعتها على زلات الغطاء 22 ملم عن طريق شفط الوسائط بالكامل من صفيحتها. ثم بذرة 200 ، 000 OPCs بلطف إلى كل زلة غطاء. يجب أن يكون حجم البذر أقل من 200 ميكرولتر لكل قسيمة غطاء.

دع الخلايا تستقر دون تحريك اللوحة بعد 10 دقائق ، ضع ملليلتر من الدافئ على كل بئر. الآن أعد تشغيل OPCs الشقيقة المتبقية. مع احتواء s omed على عوامل النمو ، يمكن استخدامها لاحقا للتحقق من التعبير عن البروتين محل الاهتمام.

علامة تحمل علامة كيناز ذات صلة بالإشارة خارج الخلية. تم استخدام بنية واحدة لتقييد إنتاج الفيروسات العدسية ، وتم استخدام الإنزيمات للتحقق من بنية العبوة وبنية الملحقات لتحديد التخفيف الأمثل للفيروس لاستخدامه في OPCs. تم معايرة فيروس العدسات الواحد بالأشعة تحت الحمراء في خلايا HEK 2 93 T في نطاق من التخفيف الفيروسي إلى خلايا HEK 2 93 T.

زادت مستويات التعبير عن الجين محل الاهتمام بمرور الوقت. بعد ذلك ، أصيبت OPCs المنقاة وزرعتها لمدة يومين على الأقل لضمان التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا. تم تأكيد مستويات FLAG و GFP في OPCs الشقيقة.

ثم تم جلوس OPCs على الخلايا العصبية DRG. ثم تمايزت OPCs إلى خلايا الدبقية قليلة التغصن ، وكما تم تقييمها من قبل الغربيين ، بدأوا في التعبير عن بروتينات المايلين. بعض الخلايا قليلة التغصن الناضجة الميالينية ، والتي تم تصورها بواسطة محاور تلطيخ MBP تم تلطيخها بواسطة خيوط عصبية أو بيتا ثلاثة توبولين لضمان أخذ كثافات المحاور في الاعتبار.

عند تحليل مستويات تكوين الميالين بعد بذر OPCs ، من المهم الثقافة. ناقلات الجنود المدرعة الشقيقة. بهذه الطريقة ، يمكن التحقق من البروتين محل الاهتمام أو العلامة الموجودة على البروتين محل الاهتمام ، في APCs الشقيقة إذا لم يكن من الممكن التحقق منه في الثقافة المشتركة.