نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder

الهدف العام من هذا الإجراء هو نمذجة داء المبيضات المخاطي باستخدام الزرد الصغير. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل محلول يحتوي أولا على ألبكان الحي في إبرة دقيقة. في الخطوة الثانية ، يتم حقن حجم محدد من خلايا الخميرة في مثانة السباحة لسمكة الحمار الوحشي الصغيرة.

بعد ذلك ، يتم فحص الأسماك بحثا عن لقاح متجانس وتحضينها للوقت المطلوب. في الخطوة الأخيرة ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لمتابعة التفاعل الديناميكي لمسببات الأمراض مع الجهاز المناعي لأسماك الزرد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تشريح مثانة السباحة بتقنية micros للحصول على صور متحد البؤر عالية الدقة.

الطريقة التي نقدمها هنا تجيب على الأسئلة الرئيسية لعلم المناعة الفطرية وكذلك علم الأحياء الدقيقة ، مثل ما هو التسلسل الدقيق للأحداث التي تؤدي إلى فشل الاستجابة المناعية لمسببات الأمراض الفطرية والمنارات المشومية على الأسطح المخاطية. قبل البدء في الإجراء ، قم بتسخين طبق حقن يحتوي على 2٪ أروس في حاضنة 33 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة ، استخدم ماصة سعة 25 مليلتر لإزالة 100 مل من الوسائط الثلاثة E بالإضافة إلى PTU من طبق اليوم الرابع ، وأسماك الحمار الوحشي بعد الإخصاب ، مع الحرص على عدم شفط أي من الأسماك ، وإضافة ملليلترين من أربعة ملليغرام لكل ملليلتر.

مخزون سلفونات الميثان Trica إلى وسائل الإعلام لتخدير. بعد 15 دقيقة ، استخدم مجهر تشريح للتعرف على الأسماك ذات المثانات المنتفخة واستخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل 30 سمكة حمار وحشي إلى طبق الحقن الدافئ. قم بإزالة الوسائط الزائدة ، ثم امسك الطبق بزاوية واستخدم خط صيد بقطر 0.012 بوصة تم لصقه بشكل فائق في الشعيرات الدموية سيليكات بورو لعمل ثلاثة خطوط من 10 أسماك محاذاة رأسيا لكل منها دوامة كاملة أنبوب من البحر الأبيض الطازج بتركيز 1.5 في 10 إلى CFUs السابعة لكل مليلتر.

ثم قم بتحميل ثلاثة ميكرولترات من محلول الخميرة إلى إبرة دقيقة مقطوعة EC. اضبط مدة النبضة على الإعداد المناسب. ثم قم بتدوير طبق الحقن للوصول إلى زاوية 20 درجة بين الإبرة الدقيقة ورأس السمكة باتجاه الجزء الخلفي من مثانة السباحة.

الآن ادفع الإبرة الدقيقة إلى مثانة السباحة ، وتأكد من وجود تجويف الإبرة في التجويف واضغط على البركة. بمجرد التحقق من الأسماك التي تم حقنها يكون أمرا سهلا نسبيا ، حيث تزيح البلعة فقاعة الهواء ويمتلئ الجزء الخلفي من مثانة السباحة لاحقا بالوسائط ، يمكن أن يؤدي الحقن المشترك للفينول الأحمر مع البلعة إلى تسهيل تصور الحقن الناجح. بعد حقن جميع الأسماك ال 30 ، قم بإغراق الطبق بثلاثة وسائط E ثم أفرغ السمك في طبق الاسترداد.

انقل 10 إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.7 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من E ثلاثة وسائط وقتل الأسماك ب 200 ميكرولتر من التراكا. بعد ذلك ، لكل ، رتب أربع قطرات من الشحوم المفرغة في مربع ، على بعد سنتيمتر واحد على شريحة صغيرة ، وأضف قطرتين من الذوبان الطازج بنسبة 2٪ إلى منتصف المربع. بعد ذلك ، ضع سمكة واحدة على شريحة زجاجية منفصلة تحت مجهر تشريح وللتحقق من توقف قلب عن النبض وإزالة الماء الزائد.

استخدم الآن زوجا واحدا من الملقط الناعم لتثبيت الرأس في وضع ثابت وآخر لسحب القناة الهضمية الأمامية. التقط مثانة السباحة عن طريق القناة الهوائية ، وافصلها عن الجهاز الهضمي ، وضعها في وسط إحدى الشرائح الصغيرة المعدة قبل أن تصلب الزرع. أخيرا ، ضع غطاء على المنديل بالضغط برفق لأسفل حتى يلامس الشحوم المفرغة والأغاروز وقم بتصوير مثانة السباحة في غضون 10 دقائق من الحصاد.

حقن أربعة نانولترات من البحر البي البي عند واحد إلى 1.5 في 10 من السابع. CFU لكل مليلتر يعطي البيانات الأكثر اتساقا مما يؤدي إلى مجموعة من 10 إلى 50 خلايا خميرة لكل سمكة. يؤدي تضييق اللقاح إلى 15 إلى 25 خلية خميرة إلى إعطاء نمط ظاهري واستجابة أكثر إحكاما.

تلعب العدلات دورا رئيسيا في مقاومة داء المبيضات في الفئران والبشر ، وتؤدي إصابة مثانة سباحة أسماك الحمار الوحشي بألبيكنس الحي إلى تجنيد سريع ومستدام للعدلات. لا يحدث ذلك عندما يتم حقن خلايا الخميرة التي تقتل الحرارة. تتطور الخيوط بسرعة بعد حقن خلايا الخميرة مع استمرار النمو الخيطي لأول 24 ساعة بعد الحقن ، وبعد ذلك يبدأ هذا الرقم في تقليل القدرة على متابعة الأسماك الفردية بشكل غير جراحي ، مما يتيح هذه الدراسات الطولية ويسلط الضوء على الاختلافات الفردية في تطور المرض واستجابات المضيف.

بروتوكول تجريبي لا يزال غير عملي في تصوير الفئران ، تفاعلات الخلايا المناعية أو الظهارية مع c albicans سهلة نسبيا في النموذج المقدم هنا. ومع ذلك ، فإن تشريح مثانة السباحة كما هو موضح للتو يحسن بشكل كبير جودة التصوير. هذا مفيد بشكل خاص عند تصور خطوط الأسماك المعدلة وراثيا حيث يتم التعبير عن التألق في كل مكان ، وهناك مضان غريب في الأنسجة المحيطة كما لوحظ في هذه الصور لمثانة السباحة التشريح من خط أسماك ألفا كاتين.

باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى قيل مثل تقنية التحول أو العلاج التثبيط الكيميائي للإجابة على سؤال مثل ، ما هو دور خلية مناعية معينة أو مسار إشارات في داء الغشاء المخاطي.