الكمي في وقت واحد T-خلية الدوائر مستقبلات الختان (TRECs) والدوائر K-حذف إعادة التركيب الختان (KRECs) من قبل في الوقت الحقيقي PCR

الهدف العام من التجربة التالية هو تقدير ناتج الغدة الصعترية ونخاع العظم عن طريق تحديد كل من دوائر استئصال مستقبلات الخلايا التائية أو حذف REX و K لدوائر استئصال إعادة التركيب أو تصحيحها في فحص واحد. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء بلازميد ثلاثي الإدخال يحتوي أولا على أجزاء من تسلسل الحمض النووي لتصحيحات TRX وجين مرجعي لنسخة واحدة من أجل الحفاظ على نسبة واحد إلى واحد إلى واحد بين الأهداف الثلاثة بعد تضخيم الحمض النووي. بعد ذلك ، يتم إنشاء منحنى قياسي عن طريق إجراء التخفيفات التسلسلية لبلازميد الإدراج الثلاثي ، والذي يسمح بالقياس الكمي المطلق للتسلسلات المستهدفة الثلاثة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي الحقيقي.

أخيرا ، يتم إجراء اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي مما يؤدي إلى القياس الكمي المطلق للشكوك والشقوق. تظهر النتائج المبلغ عنها التغيرات في إخراج الغدة الصعترية ونخاع العظم مع العمر والجنس لدى الأطفال والبالغين الأصحاء. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما احتجنا إلى تحليل كل من نخاع العظام وإخراج الغدة الصعترية عند الأطفال حديثي الولادة أو الرضع ، مع الأخذ في الاعتبار أن كمية الدم التي يتم سحبها عادة نادرة مقارنة بالبالغين.

لذلك ، قررنا الجمع بين طريقتي المسارات وتصحيح القياس الكمي في اختبار واحد من أجل تحسين تكاليف تحضير العينة والكاشفة. يمتد تأثير هذه التقنية إلى تشخيص نقص المناعة الأولي والمكتسب ، ولكن يمكن أيضا استخدام الطريقة في جميع الأمراض التي تنطوي على فقدان خلايا TMB وكذلك لدراسة إعادة التكوين الجديدة بعد زرع نخاع العظم من خلال هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للأمراض البشرية. يمكن تطبيقه أيضا على البحوث الأساسية بشكل أساسي التي تنطوي على توازن الخلايا الليمفاوية.

الميزة الرئيسية هي من خلال توظيف فائض ثلاثي في منتصف هناك حاجة إلى علاج قياسي واحد فقط ، وبالتالي تقليل التباين التجريبي. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب الإجراء المطول المطلوب لإعداد البلازميد ثلاثي الإدخال أو بسبب المشكلات المتعلقة بإعداد المنحنى القياسي. للبدء ، احصل على عينة تحتوي على خلايا من المحتمل جدا أن تحتوي على TRX وتشققات يمكن اكتشافها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل الدم المحيطي لشخص شاب سليم تم جمعه في أنابيب EDTA باستخدام طريقة فصل التدرج القياسي الكثافة.

افصل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة بعد استخراج الحمض النووي من الخلايا وفقا لبروتوكول النص ، واستخدم البادئات الخاصة بجين ثابت Fort TRX REX و TCR alpha لتضخيم إشارة Rex ، ومفصل إشارة Rex المشترك وشظايا الجينات الثابتة TCR alpha. أدخل منتج PCR لمفصل إشارة Trax في موقع متقبل TA لناقل PCR 2.1 topo واستخدم الحمض النووي البلازميد لتحويل XL واحد خلايا زرقاء مختصة كيميائيا عن طريق عزل الصدمات الحرارية ، وعزل المستعمرات البيضاء المقاومة للأمبيسلين التي فقدت تكملة بيتا لاكتاز في طبق رئيسي جديد واستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد المستعمرات التي تحتوي على جزء الرحلة. بعد زراعة إحدى المستعمرات الإيجابية وعزل الحمض النووي ، استخدم SP واحد لهضم البلازميد والمنتج المضخم الجيني الثابت TCR ألفا وربط جزء الجين الثابت ألفا TCR في البلازميد.

كرر التحويل واختيار المستعمرة وتوسعها وعزل الحمض النووي لإدخال الجزء الصحيح ، واستخدم الثلاثة الخلفية بدلا من SP واحد لهضم البلازميد وجزء PCR الصحيح وكرر العملية لربط الحمض النووي وعزله. بمجرد التحقق من تسلسل الإدخالات الثلاثة ، قم بتوسيع المستعمرة وتنقية الحمض النووي البلازميد عن طريق إعداد MIDI وفقا لبروتوكول النص لإعداد منحنى قياسي. بعد حساب كتلة وتركيز البلازميد كما هو موضح هنا ، قم بإذابة جزء من البلازميد وتظهر واحدا لخطية ميكروغرامين مع الحصة الخطية للحمض النووي.

استخدم الصيغة C واحد V واحد يساوي C اثنين V اثنين. لحساب حجم التخفيف اللازم لإعداد نقطة المنحنى القياسية الأولى للسلسلة كما هو موضح هنا ، قم بإعداد سلسلة من واحد إلى 10 تخفيفات للحصول على نقاط المنحنى القياسية المتبقية. قم بتخزين تخفيف البلازميد عند سالب 80 درجة مئوية حتى الاستخدام لتحضير عينات ل Realtime PCR ، قم بترتيب لوحة PCR تتضمن نسختين مكررتين على الأقل لكل عينة ليتم تحليلها بالطريقة التالية باستخدام أنبوبين منفصلين ، أحدهما ل Rex والشقوق ، والآخر لثابت ألفا TCR.

قم بإعداد الخلطات الرئيسية لإجمالي عدد الآبار المطلوبة. أضف 20 ميكرولتر إلى آبار اللوحة. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الجيني المستخرج من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة أو P BMCs.

أضف خمسة ميكرولترات من الماء إلى آبار التحكم بدون قالب قبل استخدام غطاء لاصق بصري لإغلاق لوحة التفاعل. ثم قم بإذابة تخفيف منحنى الحمض النووي البلازميد القياسي وقم بإعداد أعلى تخفيف. اكتشف فقط الآبار الموجودة بين الصفوف من A إلى H والأعمدة من واحد إلى أربعة.

وبعد دوامة قصيرة ، أضف خمسة ميكرولترات من كل نقطة تخفيف إلى المخصصة. تأكد جيدا من عدم وجود فقاعات في قاع الآبار وأن الكواشف مستقرة في الأسفل. استخدم نظام PCR في الوقت الفعلي لتشغيل الفحص باستخدام البروتوكول التالي.

50 درجة مئوية لمدة دقيقتين والتسخين الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 45 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. ومسبار تمهيدي مشترك ه الركوع والاستطالة عند 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. لتحليل بيانات PCR في الوقت الفعلي ، افتح ملف النتائج المحفوظ في البرنامج وانقر فوق علامة تبويب النتائج أعلى النافذة.

انقر فوق قائمة التحليل وحدد إعدادات التحليل. دع البرنامج يحدد العتبة تلقائيا عن طريق تحديد جميع أجهزة الكشف والتصوير المقطعي المحوسب التلقائي لدورة العتبة. دع البرنامج يقوم بتعيين خط الأساس التلقائي لإزالة الخلفية افتراضيا.

انقر فوق علامة التبويب المسماة مخطط التضخيم ، وفي الجزء الأيمن من النافذة ، حدد أحد أجهزة الكشف الثلاثة في القائمة المنسدلة المقابلة. أدناه مباشرة حدد CT اليدوي لتعيين عتبة يدويا في الجزء السفلي من النافذة ، حدد الآبار المقابلة لنقاط تخفيف المنحنى القياسية للكاشف المختار لإظهار مخططات التضخيم بالنقر فوق الماوس وسحبه فوق الخلايا المقابلة للجدول. لضبط العتبة يدويا، اسحب خط العتبة الحمراء لأعلى ولأسفل، ثم انقر فوق تحليل لإعادة تحليل النتائج.

للتحقق من كيفية تأثير تعيين العتبة على النتائج ، حدد علامة تبويب التقرير واطلع على CT الناتج عن نقاط تخفيف المنحنى القياسية المعنية. عند تحريك العتبة للحصول على الموضع الأمثل في علامة تبويب مخطط التضخيم ، تحقق من أن العتبة في منطقة تضخيم أسي أعلى بدرجة كافية من ضوضاء الخلفية ، ولكن أسفل مرحلة الهضبة. إذا لم يتم عرض مخطط التضخيم في مقياس لوغاريتمي ، فانقر بزر الماوس الأيمن على المخطط لاستدعاء إعدادات الرسم البياني وتعيين إعداد تشغيل Y ais كسجل.

اضبط العتبة في منتصف الطريق في الجزء الخطي من المؤامرة ولاحظ منحنيات التضخيم موازية لبعضها البعض تقريبا. انقر فوق علامة تبويب التقرير لرؤية نتائج التصوير المقطعي المحوسب. تأكد من أن موضع العتبة أنتج نتائج تزيد من دقة التكرارين لكل منحنى قياسي.

نقاط التخفيف. تحقق من وضع العتبة عند النقطة التي تعكس على أفضل وجه أوامر الحجم القصوى لنقاط تخفيف المنحنى القياسية ضمن علامة تبويب التقرير. اسحب الماوس مرة أخرى في الجدول الموجود في الجزء السفلي من النافذة لتحديد الخلايا المقابلة لآبار المنحنى القياسي بالنسبة لجميع أجهزة الكشف ، تحقق من أن التصوير المقطعي المحوسب الناتج للأهداف الثلاثة متشابه جدا في نفس نقاط التخفيف.

على سبيل المثال ، الفرق ، لا يزيد عن 0.5 CT إعادة ضبط العتبات إذا لزم الأمر ، وإعادة التحقق ضمن علامة تبويب التقرير في الجزء السفلي من النافذة. حدد آبار NTC وتحقق من عدم وجود تضخيم في آبار NTC ، وهو ما يتوافق مع CT غير محدد. حدد علامة تبويب المنحنى القياسي وعلى يمين نافذة المخطط ، حدد أجهزة الكشف من القائمة المنسدلة ومعرفة ما إذا كان ميل المنحنى القياسي المبلغ عنه يتراوح بين سالب 3.55 وسالب 3.32 ، وهو ما يتوافق مع كفاءات تفاعل البوليميراز المتسلسل من 91 إلى 100٪ تأكد من أن معامل التحديد أو R تربيع أعلى من 0.998 عن طريق التحقق من قيمته أسفل المنحدر والاعتراض.

انقر فوق علامة تبويب التقرير وفي الخلايا المقابلة للجدول أسفل الرسم البياني ، تحقق من أن التصوير المقطعي المحوسب للتحكم الإيجابي متوافق مع نتائج المقايسات السابقة على نفس عنصر التحكم الإيجابي المعروف. انقر فوق قائمة الملف ، واحفظها ، ثم قم بالتصدير إلى ملف CSV لتصدير كميات جميع الآبار في ملف نصي يحتوي على قيم مفصولة بفواصل. أخيرا، قم باستيراد ملف CSV في برنامج جدول بيانات وحساب عدد المسارات أو التصحيحات لكل 10 إلى ستة PBMs عن طريق تعيين الصيغة التالية بشكل مناسب.

تم إجراء الاختبار الموصوف في هذا الفيديو على عينة تمثيلية من 87 ضابطا صحيا. 42 طفلا تتراوح أعمارهم بين صفر حتى 17 و 45 بالغا تتراوح أعمارهم بين 24 و 60. كما هو موضح هنا ، انخفض عدد الرحلات بشكل حاد مع تقدم العمر بسبب الالتفاف الصعتري من صفر إلى ثلاث إلى أربع سنوات عند البالغين.

يعتمد رقم الرحلة أيضا على الجنس لأنه يتناقص بسرعة أكبر عند الرجال منه عند النساء ، مما قد يؤثر على القدرة على تحديد النطاقات المرجعية المناسبة. تظهر هذه الرسوم البيانية أن عدد الشقوق ، مع ذلك ، انخفض مع تقدم العمر على غرار النمط الذي شوهد مع T TREXs عند الأطفال فقط. بينما في البالغين ، يكون إخراج نخاع العظم مستقرا إلى حد ما طوال الحياة ولا يعتمد على الجنس.

يتطلب تحضير البلازميد الثلاثي حوالي أسبوعين أو ثلاثة أسابيع ، ولكن بعد ذلك ، ستستمر مخصصات البلازميد المخزنة لمدة ثلاث سنوات. يمكن القيام بالجزء المتبقي من التقنية في غضون أربع إلى خمس ساعات فقط إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا إجراء جميع عمليات التلاعب المتعلقة بالبلازميد في منطقة مخصصة لتجنب التلوث المتبادل للحمض النووي.

من الضروري أيضا التحقق من استقرار الأنبوب القياسي عند تحليل النتائج بعد تطويره. وفرت هذه التقنية للباحثين في مجال علم المناعة السريرية أو أمراض الدم ، أداة محسنة لتحديد أوجه القصور المناعية الأولية لمراقبة نتيجة إعادة تكوين المناعة ، بعد زرع نخاع العظم ، أو لدراسة توازن الخلايا الليمفاوية ببساطة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على الثلاثي في البلازميد ، وإعداد المنحنى القياسي ، وإجراء تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وإجراء الحسابات اللازمة للحصول على تقدير كمي مطلق قابل للتكرار للتراكس والشقوق.