افتعال ركائز الثقافة معقدة باستخدام الروبوتية Microcontact الطباعة (R-μCP) وتبديل أليف النواة متسلسل
October 31st, 2014
ركائز زراعة الخلايا التي تعمل بأنماط دقيقة من الروابط البيولوجية لها فائدة هائلة في مجال هندسة الأنسجة. هنا ، نوضح التصنيع متعدد الاستخدامات والآلي لركائز زراعة الأنسجة باستخدام فرش متعددة متعددة من البولي (إيثيلين جلايكول) ذات منقوشة دقيقة تقدم كيمياء متعامدة تتيح تثبيت الروابط البيولوجية الدقيقة مكانيا والخاصة بالموقع.
الهدف العام من التجربة التالية هو توليد ركائز لزراعة الأنسجة باستخدام فرش PEG متعددة ذات أنماط دقيقة ، وتقديم كيمياء متعامدة تتيح تثبيت الروابط البيولوجية الدقيقة مكانيا والخاصة بالموقع. يتم تحقيق ذلك من خلال مصفوفات الترسيب من أكان ثيول ، وهو بادئ TRP بواسطة طباعة روبوتية دقيقة على ركائز مطلية بالذهب. كخطوة ثانية SI ، يتم تنفيذ TRP على ركائز النمط الصغير ، والتي تولد فرش PEG مع مجموعات البروم الطرفية.
بعد ذلك ، يتم تشغيل مجموعات البروم الطرفية بمجموعة أو مجموعتين من التفاعلات الكيميائية من أجل السماح بتعبئة الروابط البيولوجية المعدة بشكل مناسب. ثم تتكرر العملية برمتها لتعمل مع مجموعة كيميائية ثانية. تظهر النتائج مصفوفات دقيقة لفرشتين من فرشتين PEG متعامدين وظيفيتين متعامدين متراكبة بدقة 10 ميكرون.
يتم التحقق من ذلك باستخدام برنامج تحليل الصور المخصص بعد اقتران المجموعات التفاعلية مع جزيئات الفلورسنت. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق مثل الطباعة اليدوية ذات التلامس الجزئي هي أن الطباعة الروبوتية ذات التلامس الجزئي قادرة على تركيب خطوات طباعة متعددة بدقة ميكرون ، مع تمكين أقصى قدر من المرونة وتصميم الركيزة. تسمح لنا الدقة التي توفرها هذه الطريقة ، إلى جانب تفاعلات الاستبدال النووية المتسلسلة ، بتوليد ركائز لزراعة الأنسجة التي يتم تشغيلها باستخدام روابط بيولوجية متعددة تكون قادرة بعد ذلك على ممارسة التحكم الزمني والمكاني للكبريتات على مقياس ميكرون.
قبل S-I-A-T-R-P ، يجب أن تكون شريحة الغطاء المطلية بالذهب منقوشة بختم A-P-D-M-S. يتم شرح هذا الإجراء الشائع نسبيا في بروتوكول نصي. ابدأ بإزالة شريحة غطاء براءة الاختراع من الروبوت عن طريق تحرير المكنسة الكهربائية.
ثم انقله إلى قارورة بطول 50 مليلتر ، وأغلق القارورة ، وقم بتطبيق مكنسة كهربائية سالبة 30 رطل لكل بوصة مربعة. بعد ذلك ، أضف 5.5 مل من خليط تفاعل TRP إلى القارورة باستخدام حقنة متبوعة بإضافة 0.5 مل من أسكوربات الصوديوم في الماء أيضا عن طريق المحقنة. لاحظ تغير لون التفاعل من الأخضر الفاتح إلى البني الداكن.
اترك التفاعل يستمر لمدة 16 ساعة تحت الغاز الخامل. عند اكتمال التفاعل ، قم بإزالة شريحة الغطاء واشطفها بالإيثانول ، ثم الماء ثم الإيثانول مرة أخرى. ثم جففه برفق بالنيتروجين.
يجب أن تكون المصفوفة الدقيقة لفرش P-E-G-M-E-M-M-A مرئية للعين المجردة. استخدم الفحص المجهري للكشف عن هذه التغييرات بالتفصيل لتشغيل سلاسل P-E-G-M-E-M-M-A. انقل شريحة غطاء النمط إلى قارورة تفاعل زجاجية سعة 20 مليلتر وأضف ستة ملليلتر من DMF يحتوي على 100 مللي مولار من أزيد الصوديوم.
دع التفاعل يستمر لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اشطف شريحة غطاء براءة الاختراع بالإيثانول وجففها تحت تيار نيتروجين لطيف لتهدئة سلاسل P-E-G-M-E-M-M-A المتبقية التي تعمل بالبروم. انقل شريحة غطاء النمط الصغير إلى قارورة تفاعل زجاجية سعة 20 ملليلتر وأضف ستة ملليلتر من DMSO تحتوي على 100 ملليمولار من أمين الإيثانول ، و 300 ملليمولار ثلاثي إيثيل أمين.
اسمح لهذا التفاعل بالاستمرار لمدة 24 ساعة عند 40 درجة مئوية في اليوم التالي. اشطف شريحة غطاء النمط بالإيثانول وجففها برفق تحت تيار النيتروجين. الخطوة التالية هي تكرار طباعة الاتصال الجزئي للروبوت باستخدام ختم PDMS ثان وختم لاحق.
استخدم SI A TRP مرة أخرى لرسم فرشاة PEG للصفيف الصغير الثاني. ثم حان الوقت لإضفاء الطابع الوظيفي على الأسيتيلين سلسلة المصفوفة الصغيرة الثانية P-E-G-M-E-A Francois. غطاء النمط الصغير.
انزلق في قارورة تفاعل زجاجية سعة 20 مليلتر مع ستة ملليلتر من أمين بروباج مولار 100 ملي في DMF. دع التفاعل يستمر لمدة 24 ساعة. في درجة حرارة الغرفة في اليوم التالي ، اشطف شريحة غطاء براءة الاختراع بالإيثانول وجففها تحت تيار نيتروجين لطيف.
ثمتكون شريحة غطاء براءة الاختراع جاهزة لابتهاج البيوتين. ابدأ بوضع شريحة غطاء براءة الاختراع الدقيقة في قارورة تفاعل زجاجية سعة 20 مل. أولا ، أكل البيوتين سلاسل الأسيتيلين المنتهية.
أضف ستة ملليلتر من كبريتات النحاس مع زيد PEG أربعة بيوتين مترافق إلى قارورة التفاعل ، متبوعا ب 1.2 مل من 0.15. حمض الملي مولار rbic في الماء لتهيئة التفاعل ، فقاعة التفاعل مع النيتروجين لمدة 10 ثوان. ثم أغلق القارورة بالشكلي واترك التفاعل لمدة 24 ساعة.
في درجة حرارة الغرفة في اليوم التالي ، اشطف شريحة الغطاء بالماء وانقلها إلى طبق بوليسترين سعة 12 جيدا. ثم في درجة حرارة الغرفة في DPBS مع مصل الحمار لمدة ساعة بعد ساعة ، قم بوضع بقع في مجموعات البيوتين المبهجة مع البكتيريا العقدية DEIN 5 46 المترافقة عند ميكروغرامين لكل مليلتر في صبغة DPBS لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة بعد ساعتين. اشطف شريحة الغطاء في DPBS خمس مرات بنباتات لطيفة.
Tobi ITIN aate السلاسل المنتهية azi. ضع زلة الغطاء في بئر من صفيحة البوليسترين المكونة من ستة آبار وقم بتطبيق ملليلترين من DPBS تحتوي على 20 ميكرومولار D-B-C-O-P-G أربعة بيوتين. ثم احتضن شريحة الغطاء لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة بعد 24 ساعة.
اشطف شريحة الغطاء كما كانت قبل أربعة وصطخها بالستربتافيدين 4 88. مترافق عند ميكروغرامين لكل مليلتر في DPBS. بعد ساعتين.
اشطف شريحة الغطاء مرة أخرى ، ثم قم بتصويرها بالفحص المجهري. باستخدام بروتوكول طباعة الاتصال الصغير للروبوت. تم تصميم مجموعة منقوشة بدقة من واجهة مستخدم ANN لفرشاة PEG مع مجموعات ألكين طرفية ضمن مجموعة منفصلة من واجهة مستخدم ANN لفرشاة PEG الأكبر حجما مع مجموعات azi الطرفية.
تم عرض التوزيع المكاني لمجموعات الأزيد والألكين باستخدام كيمياء النقر وربط الستربتافيدين لمجسات الفلورسنت. يظهر تراكب كلتا القناتين الفلورية كيف لم تتداخل الطوابع. تم حساب دقة المحاذاة لتكون أقل من 10 ميكرون ، وهي في حدود SCAR.
نظام يستخدم للقيام بالطباعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء ركائز مخصصة لزراعة الأنسجة باستخدام طباعة الاتصال الدقيقة الروبوتية لتراكب مصفوفات فرشاة الوتد المتعددة. تعمل مع الكيمياء المتعامدة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تظهر هذه الدراسة التصنيع الآلي لركائز زراعة الأنسجة مع فرش البولي (الإيثيلين جليكول) (PEG) ذات الأنماط الدقيقة. تعرض هذه الفرش كيمياء متعامدة تسهل التثبيت الدقيق مكانيًا وتحديد المواقع للروابط البيولوجية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- هندسة الأنسجة
- المواد الحيوية
- التصنيع المجهري
الخلفية
- ركائز زراعة الخلايا ضرورية لتطبيقات هندسة الأنسجة.
- النمط المجهري يسمح بالتحكم الدقيق في عرض الروابط.
- فرش PEG هي مواد متعددة الاستخدامات للوظيفنة.
- الكيمياء المتعامدة تمكن من تعديلات السطح المعقدة.
هدف الدراسة
- لإنشاء ركائز زراعة الأنسجة مع فرش PEG متعددة الأنماط الدقيقة.
- لتمكين التثبيت المحدد للمواقع للروابط البيولوجية.
- لإظهار أتمتة عملية التصنيع.
الطرق المستخدمة
- الطباعة الروبوتية بالاتصال الدقيق لعكان الثيول على الركائز المطلية بالذهب.
- البلمرة التسلسلية المنشطة بالسطح لنقل الراديكالية (SI-ATRP) لتوليد فرش PEG.
- وظيفنة مجموعات البروم الطرفية مع مجموعات كيميائية تفاعلية.
- تكرار العملية لتحقيق الوظيفنة المزدوجة.
النتائج الرئيسية
- الإنشاء الناجح للمصفوفات الدقيقة مع اثنين من فرش PEG الوظيفنة متعامدة.
- تحقيق دقة تراكب 10 ميكرون.
- إظهار التنوع في وظيفنة الركيزة.
- تمكين التثبيت الدقيق مكانيًا للروابط.
الاستنتاجات
- تتيح الطريقة تعديلات سطح معقدة في هندسة الأنسجة.
- العمليات الآلية تعزز التكرارية والكفاءة.
- تطبيقات محتملة في مجالات البحث البيولوجي المختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Robotic microcontact printing (R-µCP) with sequential nucleophilic substitution enables the fabrication of culture substrates with highly ordered, micron-scale patterns of orthogonally functionalized PEG brushes. This precision supports spatially controlled ligand immobilization, directly impacting early discovery and target validation workflows in tissue engineering and advanced cell models. The method's reproducibility and alignment accuracy address critical needs for predictive confidence and translational continuity in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions with spatially defined ligand presentation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise control of microenvironmental cues.
- Facilitates functional target validation through site-specific immobilization of biological ligands.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible substrates for downstream cell-based assays.
- Delivers quantitative, spatially resolved outputs for compound or ligand screening.
- Enables scalable and reusable platform design for high-content screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro substrate architecture with in vivo tissue microenvironments for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling complex tissue engineering.
- Provides predictive de-risking for biomaterial and cell therapy development pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery, assay development, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of cell behavior in engineered microenvironments.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing ligand or compound effects.
- Analytics: Supports high-resolution imaging and quantitative analysis of spatial patterning and ligand immobilization.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by mimicking tissue-specific architectures.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse R&D programs requiring spatially controlled substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Delivers high reproducibility, micron-scale alignment, and flexible substrate design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue engineering and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, robotics, and microfabrication techniques.
- Demands access to robotic microcontact printing instrumentation and imaging analytics.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different cell types or ligand chemistries.
- Micron-scale alignment is limited by the precision of robotic and imaging systems.
![[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F3636.jpg%3Fv%3D2026-07-07T12%253A46%253A19.222Z&w=384&q=75)
