تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد التغيرات في عملية البلعمة أو العمل في البلمرة بعد إضافة ناهضات أو مضادات العقد. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة جزيئات مصنفة بالفلورسنت إلى الخلايا البلعمية وإتاحة الوقت الكافي لحدوث البلعمة. كخطوة ثانية لوقف البلعمة ، يتم التعامل مع الخلايا باللون الأزرق لإطفاء مضان الجسيمات غير الداخلية التي يتم غسلها وتثبيتها لاحقا باستخدام الباريالديهايد.

التالي هو التلوين والقياس الكمي. من أجل تسهيل الكشف عن الفلورسنت للخلايا والجسيمات ، والخلايا المدعمة ب DPI أو الأكتين ، تظهر النتائج تأثير العلاج على البلعمة وبلمرة الأكتين كما تم تحديدها كميا من خلال نسبة مضان أحمر أخضر إلى أزرق بناء على التحليل المتري الفلوري. الميزة الرئيسية لتقنية الفلورو متري على الطرق الحالية هي أنها طريقة عالية الإنتاجية وفعالة من حيث التكلفة لتقييم البلعمة.

يسمح بالحد الأدنى من معالجة العينة والقياس الكمي السريع لكثافة الفلورسنت لكل خلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة وبيولوجيا الخلية ، مثل مدى فعالية وسرعة إزالة مسببات الأمراض. تغير بلمرة العمل أثناء البلعمة وكيف يتم تعديل البلعمة أو بلمرة المحاور بواسطة ناهضات أو خصوم.

لبدء لوحة الإجراء ، تحتضن البلاعم من خط خلية Murine J 7 74 في صفيحة 96 بئر ذات قاع شفاف أو أسود خلايا الالتصاق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين للسماح بدخول اللوحة. ثم أضف ناهضات أو مضادات المطلوبة أو التحكم في السيارة إلى الخلايا بتركيز اثنين × في 50 ميكرولتر من PBS أو الوسائط المكملة واحتضانها لفترة زمنية مطلوبة. في هذه الخطوة ، تأكد من حماية جزيئات الفلورسنت والملصقات من الضوء في جميع الأوقات أثناء المعالجة والغسيل والحضانة.

من أجل منع التبييض الضوئي ، لاستخدام الجسيمات في التعليق مثل حبات dextra المصنفة بالفلورسنت ، ومحلول المخزون لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف كمية متساوية من الكاشف المضاد إلى جزيئات الفلورسنت وقم بالدوامة بقوة لمدة دقيقة أخرى. بعد ذلك ، احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة بعد الحضانة ، كانت الجسيمات خمس دقائق.

عند 500 مرة G.قم بإزالة المادة الطافية S التي تحتوي على كاشف مضاد زائد. بعد ذلك ، اغسل الجزيئات ب 100 ميكرولتر من PBS. دوامة العينة لإعادة تعليق الحبيبات والطرد المركزي لها لمدة خمس دقائق من 500 إلى مرات G.كرر هذه الخطوات مرتين أخريين لضمان التحسين المناسب وإزالة الجسم المضاد غير المرتبط.

لتحضير محلول العمل للجزيئات المتأينة ، أعد تعليق الجسيمات في خمسة ملليلتر من الوسائط. ثم قم بتخزينه بعيدا عن الضوء حتى الاستخدام الآخر. الآن ضع محلول عمل الجسيمات في خزان كاشف معقم.

أضف 50 ميكرولترا من جزيئات opsonize إلى الخلايا المحضرة مسبقا إلى تركيز نهائي يبلغ 15 نانوغراما لكل مليلتر ، واسمح للبلعمة بالحدوث في ظروف زراعة الخلايا القياسية. بالنسبة لطريقة البلعمة المستمرة ، اترك 30 دقيقة إلى ساعة واحدة حتى تصل جزيئات الفلورسنت إلى قاع البئر وتتواصل مع الخلايا. في حالة إجراء تجربة دورة زمنية ، أضف البكتيريا على فترات زمنية مختلفة وأوقف لوحة التفاعلات بأكملها في نفس الوقت.

لتعزيز سرعة معالجة خلايا الالتصاق ، قم بإزالة السنيت وإضافة 50 ميكرولترا من اللون الأزرق المخفف مع PBS من أجل إطفاء مضان البكتيريا غير الداخلية بعد حضانة التريان. اغسل الطبق مرتين باستخدام PBS لإزالة أي بقايا ثلاثية. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا ب 50 ميكرولتر من 4٪ بارالديهايد واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسل الطبق باستخدام PBS. قم بإزالة كل السائل وأضف 50 ميكرولتر من DPI بعد خمس دقائق من التلوين ، اغسل الطبق مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من PBS إلى كل بئر وسجل البلعمة بعد تثبيت الباربالديهايد.

اغسل الطبق مرتين ب 100 ميكرولتر من PBS لكل بئر لكل غسلة. ثم أضف 50 ميكرولترا من 0.1٪ Triton X 100 في PBS إلى الخلايا للتغلغل واحتضانها لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل 0.1٪ Triton X بعيدا باستخدام PBS مرتين.

بعد ذلك ، قم بحظر الخلايا باستخدام 1٪ BSA لمدة 20 دقيقة لتجنب الارتباط غير المحدد للملصق. الآن قم بإعداد محلول العمل لصبغة قضيب الدومين عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول مخزون الميثانول في خمسة ملليلتر من PBS. بعد الحظر، قم بإزالة حل BSA على الفور.

أضف 50 ميكرولترا من الكرم ومحلول العمل إلى كل بئر واحتضان الخلايا في الظلام لمدة 20 دقيقة من درجة حرارة الغرفة. لتحديد البلعمة ، ضع اللوحة في قارئ لوحة الفلورسنت سجل التألق الأخضر باستخدام مرشح إثارة بطول موجي 488 نانومتر ومرشح انبعاث بطول موجي 518 نانومتر ومضان أزرق باستخدام مرشح إثارة بطول موجي 355 نانومتر ومرشح انبعاث بطول موجي 460 نانومتر. لتحديد بلمرة الأكتين باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت ، قم بتسجيل التألق الأحمر عبر مرشح إثارة بطول موجي يبلغ 584 نانومتر ومرشح انبعاث بطول موجي يبلغ 620 نانومتر ومضان أزرق.

مرشح النار والإثارة بطول موجي 355 نانومتر ومرشح انبعاث بطول موجي 460 نانومتر. بعد ذلك ، اقسم إجمالي RFU للتألق الأخضر أو الأحمر على قراءة التألق الأزرق اعتمادا على تسمية الجسيمات أو البلعمة مقابل الأكتين الكمي بسبب اللوحة العالية. للوحة التباين ، استخدم المؤشرات النسبية لتوضيح الاتجاهات الملحوظة بشكل أفضل ولتسهيل التحليل الإحصائي الأكثر موثوقية.

توضح هذه الصورة التغيرات في بلمرة الأكتين بعد إضافة المثبط. هذه هي تكوين الأرجل الكاذبة وهنا التغييرات في تكسير الغشاء. في هذه الصورة ، سمح للخلايا باستيعاب حبات X المترافقة الفيتزي بنسبة 20 إلى حبة واحدة إلى الخلية لمدة 60 دقيقة.

ثم تغسل الخلايا مع trian و PBS ثابتة مع بارالديهايد ، منفذة مع الأسيتون والبقع ل F actin باستخدام قضيب الدومين ، F الخاصرة و DPI ، البلعمة المستمرة للجسيمات المضادة وغير المؤكسدة قابلة للمقارنة تماما. حيث تقوم خلايا J 7 74 باستيعاب حبات dextra. ومن المثير للاهتمام أن بلمرة الأكتين بعد البلعمة تزداد وتتباطأ في نقاط زمنية لاحقة بينما لا تزيد بلمرة الأكتين بعد استيعاب جزيئات unop أيا من طرق البلعمة باستخدام جسيمات dextra يؤدي إلى تغييرات في بقاء الخلية بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعة إلى ساعتين باستخدام لوحات متعددة في وقت واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التحليل المتري الفلوري كطريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة عالية الإنتاجية لتحليل البلعمة والعمليات الخلوية الأخرى.