عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على المورين الأولي أو الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ أو MBX. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الأدمغة الأمامية الخالية من السحايا للفئران البالغة ثم تجانسها. في الخطوة الثانية ، تتم معالجة تجانس الأنسجة بشكل أكبر عن طريق الهضم الأنزيمي.

ثم في الخطوة الأخيرة ، يتم فصل الخلايا البطانية عن طريق الكثافة والتدرج والطرد المركزي ومطلية لزراعة الخلايا. في النهاية ، يمكن استخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي للخلايا المعزولة لتعبير CD 31 لتأكيد نقاء الثقافة الميكانيكية MB. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية ، مثل استخدام الدماغ الخالد ، خطوط الخلايا البطانية ، هي أن النتائج التي تم الحصول عليها من الخلايا الأولية توفر قابلية نقل أفضل إلى الوضع في الجسم الحي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البحث عن حاجز الدم في الدماغ ، على سبيل المثال ، المسارات التي تشارك في التفكير في الخلايا المناعية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج الأمراض العصبية الوعائية أو المعدية أو الالتهابية أو التنكسية في الجهاز العصبي المركزي. نظرا لأن ضعف الحاجز الدموي الدماغي يشارك بشكل حاسم في مسببات الأمراض لمثل هذه الأمراض.

سيتم توضيح هذا الإجراء من قبل ليزا إيبينغ ، طالبة دراسات عليا من مختبرنا. بعد عزل الأدمغة من عشرة أسابيع إلى 12 أسبوعا من العمر C 57 BL ستة فئران تخزن الأنسجة في خمسة ملليلتر من PBS المعقم. بعد ذلك ، استخدم ملقطا لإزالة سيقان الدماغ والمخيخ والمهاد ، ثم قم بلف كل دماغ بعناية على ورق نشاف معقم.

لإزالة السحايا تجمع الأدمغة في أنبوب صقر 50 مليلتر وإضافة 13.5 مل من DM em ثم فرم الأنسجة أولا بماصة 25 ملليلتر ، ثم بماصة 10 ملليلتر حتى تصبح الوسائط حليبية. هضم الأنسجة الموجودة في الكولاجيناز والحمض النووي عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري بسرعة 180 دورة في الدقيقة. بعد ساعة ، أضف 10 مل من DM em إلى تعليق الأنسجة وقم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق عند 1000 Gs وأربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات السائبة ، ثم استخدم ماصة سعة 25 ملليلتر لتصريف الحبيبات حوالي 25 مرة في 25 مل من B-S-A-D-M-E-M. بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، استخدم ماصة زجاجية مكسورة بقطر كبير لإزالة طبقة المايلين العلوية اللبني. ثم قم بإزالة طبقة BSA باستخدام PEs أو ماصة عادية.

أعد تعليق الحبيبات في تسعة ملليلتر من DM em ، ثم أضف ملليلتر واحد من مساحة قرص الكولاجيناز و 0.1 ملليلتر من الحمض النووي إلى الخلايا. هضم المحلول عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري عند 180 دورة في الدقيقة. أثناء الهضم يثبت تدرج كثافة [بركا] في [ألترا سنتريفوجغ].

بعد ساعة, أضف 10 ملليلتر من DM E em إلى تعليق الخلية المهضومة لإيقاف التفاعل ثم تدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلترين من DM E em, أضف تعليق الخلية بعناية أعلى التدرج لكل مكالمة, ثم افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد الفصل ، قد تكون الخلايا مرئية كواجهة غائمة. اغمس بعناية على طول الإبرة المعقمة في الواجهة بزاوية 30 درجة واجمع ما يقرب من 12 مل من المحلول.

غالبا ما تكون الواجهة غير مرئية للحصول على أكبر عدد ممكن من الخلايا بأقل قدر ممكن من التلوث. يجب استنشاق كمية صغيرة من الواجهة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن ينتقل طرف الإبرة المعقمة بعناية وبشكل مستمر إلى كل جزء من الواجهة ، ونقل الخلايا إلى 50 مليلتر فالكون جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من DM em ، ثم بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، reus ، قم بتعليق الحنك في 0.2 مل من وسط الخلية البطانية لكل سنتيمتر مربع واحد من سطح لوحة زراعة الخلية.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الطلاء من ألواح زراعة الخلايا المطلية واشطف كل بئر باستخدام PBS معقم في خطوتين متتاليتين للغسيل. أخيرا ، حافظ على مزارع الخلايا في وسط الخلية البطانية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة معقمة. تغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام بعد العزل مباشرة.

تشكل الفئران BM e والخلايا الملوثة تكتلات يمكن ملاحظتها تطفو في ثقافة الخلايا. يؤدي العلاج المتوسط بالميسين إلى اختيار الفئران BMAX حيث أن الخلايا الملوثة أكثر عرضة للسمية الخلوية بوساطة الميسين ويبدأ BM E غير المتأثر في الارتباط بالكولاجين الأربعة صفائح ثقافة الخلايا المطلية بالفيبرونيكتين حتى اليوم الخامس ، تتكاثر BME إلى كثافة تقارب 80 إلى 90٪ لتشكيل طبقة أحادية من معبأة بإحكام ، خلايا تثبيط ملامسة محاذاة طوليا وغير متداخلة تتميز بمظهرها النموذجي على شكل مغزل عن طريق اختيار puram Mycin ، يتم الوصول إلى نقاء عال يصل إلى 99٪ من BMAX للفئران كما أكدته علامة الخلية البطانية CD 31. تشكل طبقة أحادية الإغلاق BM E مترابطة بإحكام بواسطة بروتينات التوصيل الضيقة.

بعد سبعة إلى ثمانية أيام من الثقافة ، تبني طبقات الخلايا هذه قيما مستقرة للمقاومة الكهربائية بين 20 إلى 30 أوم بسنتيمتر مربع وسعة دسمة في هذا الوقت ، يمكن إجراء المقايسات الوظيفية مثل تجارب هجرة الخلايا أو اختبارات النفاذية باستخدام إيفانز الأزرق أو ديكستران بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع إلى خمس ساعات بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات الهجرة أو تجارب النفاذية أو القياسات الفيزيولوجية الكهربية لمعالجة تلك الأسئلة ذات الرؤية ، على سبيل المثال ، كيف يتم تغيير الاتجار بالخلايا المناعية في ظل ظروف تجريبية معينة؟

أو كيف تشارك قنوات الحديد في تنظيم الحاجز الدموي في الدماغ؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل البول والخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ عن طريق التجانس الميكانيكي ، والأنزيمي ، والهضم ، والطرد المركزي المتدرج الكثافة.