FIM التصوير وFIMtrack: اثنان أدوات جديدة تسمح عالية الإنتاجية والتكلفة تحليل تحرك الفعال

الهدف العام من المنهجية التالية هو تصور وتحديد حركة ذبابة الفاكهة ميلان يرقات Gaster ، مما يسمح بالفحص عالي الإنتاجية في ظروف الحركة الحرة. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء سطح تتبع على إعداد FIM واستخدام الانعكاس الداخلي الكلي المحبط للإضاءة غير المباشرة. ثم يتم وضع يرقات من أنماط وراثية مختلفة على السطح ويتم تسجيل سلوك الزحف استجابة لتدرج الحرارة.

ثم يتم تحليل مقاطع الفيديو بواسطة مسار FIM. تستخدم البرامج والبيانات التي تم الحصول عليها لإنشاء مخططات تصف الاختلافات في اليرقات وأنماط الحركة. أظهرت النتائج أن التقديرات الكمية الدقيقة والعالية والإنتاجية المرنة وسهلة الاستخدام لليرقات.

يمكن إجراء الحركة بناء على تقنية التصوير FIM وبرنامج تتبع FIM المرتبط بها. الميزة الرئيسية لتقنية التصوير هذه للطرق الحالية مثل استخدام الضوء الساقط أو الضوء المنقول ، هي أن فقط التي تلامس السطح مرئية ، مما يؤدي إلى تباين رائع في الخلفية الأمامية مع عدم وجود قطع أثرية مزعجة ، على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا الحمم البركانية. يمكن أيضا تطبيقه لدراسة سلوك المشي والذباب وحركة الكائنات الحية الأحادية الأخرى مثل أناقة البحر أو الجلسات العامة أو حتى نمو جذور النباتات.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لإقناع الآخرين بأن التكنولوجيا المعقدة سهلة الاستخدام. تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء سطح زاحف رطب لطريقة التصوير القائمة على FITR أو fim. للقيام بذلك يغلي ، 0.8٪ مثقاب من الدرجة الغذائية في ماء عالي النقاء منزوع الأيونات.

صب المثقاب الساخن على طبق زجاجي أكريليك. لا تقم بتقليب المثقاب بعد الغليان واسكبه باستمرار. لتجنب الفقاعات عند درجة الحرارة هذه ، يجب إنشاء لوح بسمك ملليمترين.

استخدم محلول المثقاب المتبقي لملء أطباق بتري القياسية التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات. سيتم استخدامها لفرز اليرقات النظيفة والمعتادة عليها قبل التجربة. بعد ذلك ، قم بقص ما يقرب من سنتيمترين من محيط لوح المثقاب للحصول على سطح مربع عادي للتسجيل.

انقل لوح المثقاب إلى إعداد FIM مباشرة بعد التبريد. عن طريق دفع المثقاب برفق فوق حافة لوح زجاج الأكريليك ، يجب أن ينزلق المثقاب في مكانه. أنت الآن جاهز لإعداد التصوير لتضمين حاجز مثقب مكروه في سطح الزحف.

قم بغلي 2.5٪ مثقاب من الدرجة الغذائية بثلاثة مولات من NACL في ماء عالي النقاء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، قم بقص شق بعرض سنتيمترين يحيط بمجال الرؤية في سطح الزحف المصبوب مسبقا. عندما تصبح جاهزا ، املأ الشق بمثقاب الملح أعلى من 0.1 إلى 0.3 سم من سطح التتبع.

بعد ذلك ، قم بإعداد جهاز التدرج الحراري. الجهاز عبارة عن صفيحة من الألومنيوم مغطاة بسطح عازل وممتلئة بالماء من المضخات في كلا الطرفين. للسماح بالتحكم في درجة الحرارة، قم بتشغيل جهاز التدرج الحراري قبل ساعة واحدة من الاستخدام وضعه فوق الإعداد للسماح له بالوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة.

يمكن استخدام هذه المرة لمزيد من الاستعدادات. عندما تصبح جاهزا ، انقل مثقاب سطح الزحف بحاجز ملح إلى الإعداد. ضع لوحة الرادياتير فوق المثقاب واضبط التباعد بين اللوحة وسطح الزحف إلى ملليمترين.

إنشاء تدرج خطي من 34 درجة مئوية إلى 18 درجة مئوية عن طريق ضبط درجة حرارة دوائر المياه إلى درجة مئوية واحدة و 45 درجة مئوية ، وهو مناسب لهذه المعدات. اسمح لسطح الزحف بالتوازن في التدرج لمدة 20 دقيقة. قبل المتابعة ، اختبر تدرج درجة الحرارة باستخدام TER لتحضير الذباب ، واسترجعه من حاضنة 25 درجة مئوية وقم بإسقاط القليل من الماء في قوارير الاستزراع لقيادة الثلث المتأخر في حركة يرقة النجوم.

بعد ذلك ، اجمع أكبر اليرقات من جدران القارورة باستخدام فرشاة رسم صغيرة ، قبل دقيقتين إلى خمس دقائق من التسجيل ، وانقل ما يكفي من اليرقات لمقطع فيديو واحد إلى طبق بتري تم إعداده مسبقا. بعد إنشاء تدرج درجة الحرارة ، قم بإعداد برنامج التسجيل. حدد عدد الإطارات لكل فيديو.

حدد مسار الحفظ وقم بإعداده للتسجيل الفوري في غضون 20 ثانية. بعد وضع اليرقات على سطح الزحف للبدء ، قم بتصوير إحدى اليرقات وضبط شدة الإضاءة للحصول على تباين جيد. عندما تصبح جاهزا ، ارفع لوحة المبرد قليلا وضع اليرقات عند 34 درجة مئوية ، على بعد سنتيمترين من حاجز الملح.

اخفض لوحة المبرد مرة أخرى وابدأ التسجيل في الظلام حتى لا تزعج. بعد التسجيل ، قم بإزالة اليرقات نظيفة وترطيب السطح. لتجنب انتشار كلوريد الصودرول الصوديوم ، لا تلمس مثقب الملح أثناء العمل ، بينما يجب أن يظل السطح رطبا في جميع الأوقات ، وتجنب الرطوبة الزائدة ، والتي يمكن رؤيتها على أنها هالات أو قطرات من اليرقات المحيطة.

في التسجيلات والتتبع المضطرب ، اسمح لسطح المثقاب بالتوازن لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل المتابعة. خلال هذا الوقت ، احفظ الصور التي تم جمعها واجمع جديدة. للتحضير للفيديو التالي ، تحكم في تدرج درجة الحرارة باستخدام TER كل خمسة مقاطع فيديو واضبط جهاز درجة الحرارة إذا لزم الأمر.

لبدء تتبع الحركة ، اضبط معلمات التتبع باستخدام خيار المعاينة. اضبط المليمتر لكل بكسل وفقا للكاميرا ومجال الرؤية. بعد ذلك ، اضبط الإطارات في الثانية بناء على إعدادات الكاميرا ، واستخدم التعليقات الواردة في نافذة المعاينة لضبط عتبات السطوع بحيث يتم اكتشاف جميع بشكل صحيح.

بعد ذلك ، اضبط عتبات حجم منطقة اليرقات ، ويتم تمييز المفردة بواسطة دوائر صفراء تصادم اليرقات باللون الأحمر ، ويتم إعطاء مساحة كل باللون الأزرق. ابدأ التتبع باستخدام الزر الموجود في أسفل اليمين بعد جلسة التتبع، ويتم تخزين صورة تحتوي على مسارات اليرقات وملف CSV الذي يحتوي على ميزات الحركة والموقف المحسوبة في دليل الصور. أخيرا ، استخدم الوحدة النمطية لعارض نتائج FIM لمراجعة نتائج التتبع وضبطها يدويا.

حدد اتجاه الزحف فيما يتعلق بالتدرج الحراري لتقييم البيانات بناء على هذا الحافز. في تمثيل اليرقة الموضحة هنا ، يتم تمييز الرأس ونقطة الذيل بين هذه النقاط. يمكن تعيين عدد فردي عشوائي من نقاط العمود الفقري بنصف قطر.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم حساب مركز الكتلة وزاوية ثني الجسم الرئيسية. تظهر هنا نتائج التصوير والتتبع FI من كاميرات مختلفة. تلتقط الصور الموجودة على اليسار ثلاث يرقات تزحف على مرحلة تتبع 10 سم × 10 سنتيمترات.

مسار الكتلة ومساحة يرقة واحدة على اليمين. يشير السهم الأحمر إلى النقطة الزمنية لنتائج الصورة المقطوعة من التطبيق. يظهر الحافز الحراري هنا كمسارات ملونة مختلفة محسوبة عبر مسار F.

تم الحصول على صور التطبيق عالية الدقة هذه لليرقات الثالثة والثانية والأولى في النجوم باستخدام عدسة ماكرو. يمكن أيضا تصوير الكائنات الحية الأخرى مثل البحر بسهولة. بمجرد إتقانها ، يمكن تحليل حوالي مائة مختبر في الساعة لكل إعداد تتبع.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما التسجيل في ظل نفس الظروف باتباع هذا الإجراء. يمكن تضمين طرق أخرى مثل التحفيز البصري الوراثي أو الكشف عن النشاط العصبي في الجسم الحي في الإعداد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لمدى سهولة تحليل الحركة بكفاءة.