Phenotyping ماوس الرئوي وظيفة في فيفو مع قدرة الرئة نشرها

الهدف العام من التجربة التالية هو تعلم كيفية قياس قدرة انتشار رئتي الفأر باستخدام كروماتوجراف الغاز المعاير. يتم تحقيق ذلك عن طريق نفخ رئتي الفأر المخدر بالغاز الذي يحتوي على النيون وأول أكسيد الكربون ، والاحتفاظ بالغاز في الرئتين لمدة تسع ثوان وجمع الغاز. ثم يتم تخفيف الغاز المسحوب من الرئتين إلى ملليلترين ويتم حقنه في كروماتوجراف الغاز.

يستخدم الامتصاص التفاضلي للنيون وأول أكسيد الكربون في الرئة لحساب قدرة الانتشار. يمكن استخدام هذا القياس لتقييم فقدان وظائف الرئة في مجموعة واسعة من نماذج أمراض الرئة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على جميع الطرق الأخرى الموجودة لقياس وظيفة الرئة في الفأر هي أن هذا قياس بسيط للغاية قابل للتكرار يمكن مقارنته مباشرة بقياسات مماثلة في البشر.

يمكن استخدام هذه الطريقة لمتابعة التغييرات في بنية الرئة التي تحدث مع مجموعة متنوعة من أمراض الرئة. يبدأ هذا البروتوكول بإعداد وحدة كروماتوجراف الغاز المزودة بالجهاز لقياس ذروة النيتروجين والأكسجين والنيون وأول أكسيد الكربون. بالنسبة لهذا التطبيق ، هناك حاجة فقط إلى بيانات النيون وأول أكسيد الكربون.

تستخدم الأداة عمود غربال جزيئي مع الهيليوم كغاز ناقل. يحتوي كروماتوجراف الغاز هذا على عمود سعة 0.8 مليلتر ويتم استخدام عينة ملليلتر لضمان التنظيف الكافي لهذا العمود قبل البدء. تقوم سلسلة من القياسات دائما بمعايرة الماكينة باستخدام ملليلترين من الغاز مباشرة من كيس عينة الغاز.

الذروة الأولى التي تظهر هي النيون ، ثم الأكسجين والنيتروجين ، والتي لا نقيسها لهذا الإجراء. أخيرا ، تظهر ذروة أول أكسيد الكربون في وقت كروماتوجراف الغاز. لقياس كل هذه القمم أقل بقليل من دقيقة واحدة.

للبدء ، قم بتخدير الفئران بالكيتامين والزيلازين. تأكيد التخدير من خلال عدم وجود حركة انعكاسية استجابة لقرصة إصبع القدم. بعد ذلك لحماية العينين ، ضع مرهما بيطريا ، ثم استئصال القصبة الهوائية للفئران باستخدام قنية مدرودة.

استخدم قنية قياس 18 للبالغين أو قنية قياس 20 للفئران الصغيرة جدا. بعد ذلك ، ابدأ بنقرات مسموعة كل ثانية. بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن ستة أسابيع ، استخدم حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لسحب 0.8 مل من الغاز من كيس خليط الغاز.

إذا كان عمر الفأر أقل من أربعة أسابيع ، فاستخدم 0.4 مل من الغاز ، ثم قم بتوصيل المحقنة بالقنية القصبية وقم بنفخ الرئتين بسرعة. ابدأ العد عقليا من واحد إلى 10 بالتزامن مع نقرات المسرع. عندما يصل العدد إلى 10 ، اسحب بسرعة حجم 0.8 ملليلتر.

خفف غاز الزفير هذا إلى ملليلترين عن طريق إضافة المساحة والهواء والوزن لمدة 15 ثانية على الأقل. من المهم جدا تضخيم الرئتين وتفريغهما في أسرع وقت ممكن. من السهل جدا إجراء التضخم السريع ، ولكن الأمر يتطلب القليل من الممارسة لسحب 0.8 مل بدقة بسرعة ، ثم حقن العينة بأكملها في كروماتوجراف الغاز.

للتحليل ، من المهم تجنب تلوث العينة عند نقلها من وإلى وإلى كروماتوجراف الغاز. يمكن القيام بذلك بعناية عن طريق تغطية العلامة بإصبع أثناء قيام GC بقياس العينة. قم بتضخيم رئة الفأر ب 0.8 مل أخرى من خليط الغاز من الكيس ، ثم قم بمعالجة هذه العينة بشكل مماثل مثل الأول.

باستخدام متوسط القيم من القياسين، احسب DFCO. يشير الرمز C إلى غازات المعايرة ، ويشير الرمز التسعة إلى العينات التي تم جمعها من. بعد تسع ثوان من التنفس.

تبلغ قيمة التحكم الاسمي DFCO المأخوذة من C 57 ستة فئران سوداء حوالي 0.77. في دراسة باستخدام نموذج الإنفلونزا PR الثماني ، لوحظ فقدان تدريجي للوظيفة في اليومين السادس والثامن في نموذج انتفاخ الرئة بعد 21 يوما من تركيب الإلتراط. انخفض DFCO بشكل معتدل ، ولكن كانت هناك تغييرات أكبر بكثير في نموذج التليف الناجم عن تركيب Blio Mycin.

أدى المسار الليفي الناجم عن البليومايسين إلى أكبر تغيير في DFCO لوحظ في أي من النماذج المرضية. هذا مهم لأن قدرة الانتشار هي أيضا علامة موثوقة للتليف لدى البشر. يلعب جين CFTR دورا مهما في التليف الكيسي وفي دراسة أجريت على الفئران التي تفتقر إلى هذا الجين ، كان هناك انخفاض كبير في DFCO.

انخفض DFCO بشكل أكبر مع العدوى الفطرية في هذه الفئران بالضربة القاضية. النموذج الشائع الاستخدام لإصابة الرئة ناتج عن LPS. في الفئران المعرضة ل LPS ، كان هناك فقدان تدريجي يعتمد على الوقت لوظائف الرئة من اليوم الأول إلى الرابع كما تم تقييمه بواسطة قياسات DFCO ، يمكن إجراء قياس DFCO بنجاح في الفئران التي لا تتجاوز عمرها أسبوعين.

الحجم الأصغر للرئة حجم نفخ أصغر يبلغ 0.4 ملليلتر. يمكن ل DFCO المقاس بهذا الحجم الأصغر إظهار الزيادة المتوقعة مع نضوج الرئة بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في بضع دقائق فقط لكل فأر قبل إجراء أي قياسات أو تقييمات أخرى لوظائف الرئة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من تنفيذ خطوة التضخم والانكماش بسرعة وتوخي الحذر عند نقل العينة حتى يتم منع التلوث.