طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي في المختبر

الهدف العام من الإجراء التالي هو تقييم تأثيرات مجموعة من الأطوال الموجية وشدة العلاج بالضوء الأحمر القريب من الأشعة تحت الحمراء على الإجهاد التأكسدي في المختبر. من أجل القيام بذلك ، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتوصيل الضوء حيث يمكننا التلاعب بالطول الموجي والشدة التي يتم تسليمها. نقوم بتركيب زينون أو مصدر ضوء عريض النطاق في مبيت على قاعدة معدنية ، ثم نضع عدسة طلاء وفلتر مياه وفتحة مدخل أمام الضوء.

تتمثل الخطوة التالية من الإجراء في توجيه الضوء المتولد من مصدر الضوء عريض النطاق من خلال المدخل والفتحة ودليل الضوء السائل ومن خلال عدسة طلاء ثانية. ثم يتم تركيب مرشحات عرض النطاق الترددي والكثافة المحايدة للحصول على الطول الموجي المطلوب وشدة الضوء. لاحظ أن المرشحات تسمح بمرور نطاق ضيق من الأطوال الموجية يشار إليها باسم النطاق الموجي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية لتقديم العلاج بالضوء الأحمر القريب ، مثل مصابيح LED أو الليزر ، هي أنها تسمح بمعالجة دقيقة ومعايرة على معلمات الطول الموجي والشدة. يتيح لنا ذلك بعد ذلك تحسين توصيل الضوء للحصول على أفضل النتائج البيولوجية التي تديرها الدراسة الحالية مثل الخلايا المنفصلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل نماذج الصدمات العصبية العضوية.

عند العمل مع أي مصدر ضوء واسع النطاق ساطع ، تأكد من عدم النظر مباشرة إلى مصدر الضوء لأنه قد يؤدي إلى تلف بصري دائم. لإعداد جهاز توصيل الضوء ، قم بتوصيل مصدر ضوء عريض النطاق مثل مصباح الزينون أو التنغستن بمصدر طاقة مناسب. ضع عدسة مجمعة أمام مصدر الضوء لإنتاج شعاع ضوئي مجمع.

مرر الضوء عبر مرشح حراري سائل لإزالة معظم الحرارة من شعاع الضوء. ضع عدسة مجمعة أمام مصدر الضوء لإنتاج شعاع ضوئي مجمع. مرر الضوء عبر مرشح حراري سائل لإزالة معظم الحرارة من شعاع الضوء.

اعتمادا على التطبيق ، قم بتركيز الشعاع المجمع على شريان مدخل دليل الضوء السائل لتوفير توصيل أكثر مرونة للضوء. في الطرف الآخر من دليل الضوء السائل ، ضع عدسة طلاء ثانية ثم حامل لمرشحات التداخل والكثافة المحايدة. يجب أن ينتج عن هذا الترتيب بقعة ضوئية مضاءة بشكل متساو لنطاق الموجة المطلوب والشدة.

قد تحتاج المسافة بين نهاية دليل الضوء ومستوى العينة إلى الاختلاف اعتمادا على المنطقة التي يجب إضاءةها. من المهم أن تتذكر أنه وفقا لقانون التربيع العكسي ، مع زيادة المسافة من نهاية دليل الضوء ، ستنخفض شدة الضوء في الدراسة الحالية. تبلغ هذه المسافة 14 سم ، مما يؤدي إلى إنتاج مقطع عرضي للشعاع يضيء بالتساوي منطقة بئر ثلاثة في ثلاثة على لوحة زراعة أنسجة 96 جيدا.

تأكد من أن الضوء الشارد من المصباح والمكونات البصرية المرتبطة به غير قادر على الوصول إلى عينات أخرى ، على سبيل المثال ، باستخدام الورق المقوى الأسود. بمجرد إنشاء الجهاز ، قم بتشغيل مبرد المياه لمرشح الحرارة السائل وتأكد من وجود تبادل للمياه من خلال غلاف الفلتر. قم بتشغيل مصدر طاقة المصباح وانتظر لمدة خمس دقائق على الأقل للحصول على مصدر ضوء النطاق العريض.

لتحقيق الاستقرار ، حدد مرشح تداخل النطاق الضيق لإنشاء النطاق الموجي المطلوب للإضاءة. قم بقياس الضوء الناتج عن المصباح في المستوى الذي سيتم وضع العينة فيه. أثناء العلاج.

يتم قياس الضوء باستخدام مسبار إشعاع معاير متصل بأطياف مناسبة. مقياس الإشعاع. استخدم مرشحات الكثافة المحايدة لضبط شدة الضوء حتى يتم الحصول على الإخراج المطلوب. في هذه الدراسة ، يتم ضبط شدة الضوء الذي يمر به كل مرشح تداخل لإعطاء خرج نوعي متساو في كل نطاق من نطاقات موجات المعالجة الأربعة.

يمكن تطبيق طريقة توصيل العلاج بالضوء الأحمر القريب من الأشعة تحت الحمراء الموصوفة على أي نوع من الخلايا أو نظام نموذج في المختبر. نعرض هنا تقنيتنا في توصيل الضوء إلى الخلايا باستخدام ورم قواتم الخلايا أو خلايا PC 12. على سبيل المثال ، خلايا الثقافة في وسط النمو.

في عام 96 ، صواني البئر المغلفة بالبوليول ليسين حتى تصبح 70 إلى 80٪ متجانسة. تحضير التركيز المطلوب من الغلوتامات أو الإجهاد البديل في وسط ثقافة النمو الكامل. هنا نستخدم 10 مللي مولار من الغلوتامات.

قم بإزالة الوسائط من الخلايا واغسلها برفق ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي عازل للفوسفات. بعد الغسيل ، أضف الغلوتامات التي تحتوي على وسائط إلى حجم إجمالي قدره مائة ميكرولتر لكل بئر. فور إضافة الغلوتامات أو الضغوطات المفضلة ، قم بتعريض الخلايا للمعالجة بالضوء بأطوال الموجات والشدة المرغوبة عن طريق وضع لوحة الثقافة تحت جهاز توصيل الضوء المعد.

تأكد من تغيير ناتج الجودة لشعاع الضوء باستخدام المجموعات المحددة من مرشحات الكثافة المحايدة. اعتمادا على الطول الموجي الذي يتم إعطاؤه. بعد الانتهاء من المعالجة بالضوء ، ضع الخلايا على سطح مستو واحتضانها عند 37 درجة مئوية في ظروف منظمة بثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

يمكن أيضا إعطاء جرعات إضافية من العلاج بالضوء الأحمر القريب من الأشعة تحت الحمراء. قبل إجراء الجولة الأخيرة من المعالجة بالضوء ، قم بإعداد الكواشف لاستخدامها للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية كمؤشر على الإجهاد التأكسدي. نستخدم هنا الأنظمة الغذائية المشار إليها التي تتألق عندما تتفاعل مع مجموعة من الأنواع التفاعلية ، بما في ذلك الديلو ، أسيتات الفلورسين D ، وإدارة العلاج بالضوء للخلايا كما هو موضح في الخطوة الرابعة ، والتأكد من معالجة الخلايا بالإنفلونزا والأطوال الموجية للضوء المرغوبة.

مباشرة بعد العلاج بالضوء ، قم بإزالة الوسائط المحتوية على الغلوتامات واغسلها مرتين باستخدام PBS. تابع المقايسات باستخدام أصباغ المؤشر التي تتألق عندما تتفاعل مع الأنواع التفاعلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بقياس التألق الناتج عن أصباغ المؤشر باستخدام قارئ لوحة مضبوطة على إعدادات الإثارة والانبعاث المناسبة.

استخدم لون المجموعة المترية لتحديد تركيز البروتين في الآبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. التعبير عن مخرجات التألق بالنسبة لتركيز البروتين لكل بئر على حدة ، ثم تحليل النتائج باستخدام البرامج الإحصائية. يمهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين الذين يحققون في تأثيرات الأطوال الموجية المتعددة وشدة العلاج بالضوء الأحمر القريب من الأشعة تحت الحمراء على الإجهاد التأكسدي.

يمكن استخدام هذه التقنية في مجموعة من الأنظمة النموذجية بما في ذلك الخلايا المنفصلة أو الثقافات العضوية.