تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

الهدف العام من هذه العملية هو زراعة عدد كبير من الخلايا في ظل ظروف المغذيات الخاضعة للرقابة. استخدام المعدات التقليدية الموجودة في مختبر زراعة الخلايا. تسمح الخوارزميات المرتبطة بالتحكم في العناصر الغذائية ومعالجتها ضمن النطاقات التجريبية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية لتطبيقات زراعة الخلايا على نطاق واسع. مثل العلاجات الخلوية البشرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مرافق زراعة الخلايا على نطاق واسع مع توزيع موحد للمغذيات والغازات.

هذا يسمح بكثافة خلايا أعلى من مزارع الخلايا الثابتة أو التي يتم تغذيتها بكميات كبيرة ، ويزيد من المحصول ، ويقلل من فقدان الخلايا. يمكن القيام بذلك باستخدام المعدات الموجودة بشكل شائع في معظم مختبرات زراعة الخلايا. قد يكون العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا للمحققين الجدد حيث قد يكون من الصعب إتقان هذه التقنيات المستخدمة ، نظرا للعدد الكبير من الخطوات التي يجب إجراؤها بترتيب معين في ظل ظروف معقمة.

اجمع المكونات الأساسية الخمسة اللازمة لنظام التغذية. خزان متوسط ، مضخة تمعجية ، مفاعل حيوي مقلوب ، خزان نفايات ، ومجموعة عينات أنابيب مصممة خصيصا. قم بإنشاء الخزان المتوسط باستخدام زجاجة زجاجية سعة لتر واحد.

خزان النفايات باستخدام زجاجة زجاجية سعة لترين. المفاعل الحيوي المقلوب باستخدام مفاعل زجاجي بحجم 250 مل. استخدم مضخة تمعجية رقمية ، أو مضخة مماثلة برأس مضخة ثماني قنوات للتحكم في التبادل المتوسط.

قم بتجميع الخزان وأغطية المفاعلات الحيوية المعدلة من البلاستيك الصلب والقابل للتعقيم. مع منافذ تمرير أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ لتوفير التهوية من خلال المرشحات المعقمة ، والسماح بالنقل المتوسط بين الخزانات والمفاعلات الحيوية. قم بتوصيل أنبوب تدفق خارجي مصنوع من أنابيب تهوية زجاجية مسامية بغطاء المفاعل الحيوي المعلق المعدل.

قم بتجميع مجموعات أنابيب التروية القابلة للتعقيم من موصلات أنابيب فلوريد البولي فينيلدين ، وأنابيب المضخة التمعجية المتينة. يعتمد طول القسم على المسافة بين المكونات المختلفة. قم بتجميع خط التغذية باستخدام قطرين من الأنبوب.

استخدم L / S 14 للأنبوب الأساسي الذي سيمتد على المسافة من المفاعل الحيوي إلى الخزان المتوسط. أدخل طول فرز من أنبوب L / S 13 في منتصف طول الأنبوب لقسم المضخة ، باستخدام محولات PVDF المناسبة. استخدم محولات الأنابيب الشائكة PVDF القياسية للانضمام إلى قطعتين من أنابيب L / S 14 على جانبي أنبوب قسم المضخة الأقصر.

قم بتجميع قسم أنبوب القسم لإزالة النفايات باستخدام أنبوب L / S 16 بقطر أكبر ، وأدخل قسما قصيرا من أنبوب L / S 14 في المنتصف لقسم الضخ. يتم ذلك بنفس طريقة تجميع خط التغذية باستخدام محولات الخرطوم الشائكة PVDF. قم بتجميع المكون النهائي لمجموعة الأنابيب عن طريق إنشاء المجموعة من ثلاثة أطوال أنابيب قصيرة L / S 14.

متصل مع موصل HVDF من النوع T ، ومشابك خرطوم صغيرة على طولين من الأنابيب. قم بتوصيل مجموعة العينة بموصل عينة الفولاذ المقاوم للصدأ المرفق بغطاء المفاعل الحيوي. بعد التعقيم ، سيتم توصيل فلتر غاز معقم لتنفيس الغاز بأحد الأطوال المثبتة.

يستخدم الآخر للاتصال بحقنة أخذ عينات معقمة. قم بتعقيم مجموعة أخذ العينات أثناء توصيلها بالمفاعل الحيوي ، قبل بدء التجربة كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم هذه المجموعة لجمع عينات معقمة من المفاعل الحيوي حسب الحاجة ، دون الإخلال بعملية التغذية المستمرة.

قم بتوصيل فتحات التهوية المعقمة بالمواقع المناسبة على أغطية القارورة الدوارة ، والوعاء المتوسط ، وأوعية النفايات ، ومنافذ العينات. استزراع وحصاد الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. اسمح للخلايا بالتحتضن في درجة حرارة الغرفة في التربسين لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في خزانة السلامة الحيوية ، ثم جمعها في أنبوب مخروطي الشكل.

ثم يتم جمع عينة خلية صغيرة وتلطيخها باللون الأزرق. احسب كثافة الخلية باستخدام مجهر ومقياس كثافة الدم القياسي مع تلطيخ التريبان الأزرق كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف العدد المطلوب من إجمالي الخلايا إلى المفاعلات الحيوية المعقمة المعلقة لكل حالة.

أضف الوسط إلى المفاعل الحيوي المعلق المخفوق باستخدام ماصة للوصول إلى الحجم الكلي المطلوب. انقل المفاعل الحيوي المعلق المقلوب مع الخلايا إلى لوحة تحريك داخل حاضنة زراعة الخلايا. زراعة الخلايا في المفاعلات الحيوية دون تغذية لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، 100٪ رطوبة نسبية ، ومعدل تحريك 70 دورة في الدقيقة للسماح بتكوين الكرويات.

بعد تكوين كروي ، قم بإزالة المفاعل الحيوي للتعليق المقلوب من الحاضنة. قم بتجميع مكونات نظام التغذية المستمرة في خزانة السلامة البيولوجية. املأ أولا خزانا متوسطا جديدا بوسط الاستزراع المطلوب ثم قم بتوصيله بجانب واحد من خط التغذية.

تأكد أيضا من تهوية الخزان المتوسط الطازج بشكل صحيح باستخدام مرشح معقم. يجب استبدال مرشح معقم في منفذ مدخل المفاعل الحيوي لتصفية الوسط قبل دخوله إلى المفاعل الحيوي. قم بتوصيل خط النفايات بخزان النفايات المتوسطة وتأكد من تهوية خزان النفايات بشكل صحيح باستخدام مرشح معقم.

ضع المفاعل الحيوي المعلق المقلوب على لوحة التحريك داخل الحاضنة باستخدام نفس معلمات الثقافة المستخدمة في التكوين الكروي. ضع الخزان المتوسط الطازج داخل ثلاجة صغيرة قريبة. تأكد من أن خطوط التغذية قادرة على الخروج من الثلاجة دون منع الأبواب من الإغلاق.

من الأهمية بمكان أيضا ألا يتم إغلاق خطوط التغذية بأبواب الثلاجة أو الحاضنة. يمكن وضع خزان النفايات الوسيط على سطح المقعد خارج الحاضنة في مكان مناسب. قم بتمرير نهايات الأنبوب المتبقية في الحاضنة وقم بتوصيل خط التغذية بالمرشح الموجود على منفذ مدخل المفاعل الحيوي.

ثم قم بتوصيل خط النفايات بمنفذ أنبوب التدفق الخارج. بعد ذلك ، ضع قسم المضخة من خطوط التغذية والنفايات في رأس المضخة ، مما يضمن الاتجاه الصحيح بحيث تضخ خطوط التغذية الوسط من الخزان المتوسط الجديد إلى المفاعل الحيوي المعلق المقلوب ، وستضخ خطوط النفايات الوسط من المفاعل الحيوي ، وإلى خزان وسط النفايات. احسب معدل التغذية باستخدام معادلة معدل التغذية المعدلة كما هو موضح في بروتوكول النص.

استخدم أحدث عينة مع معلومات عدد الخلايا ، جنبا إلى جنب مع التنبؤ بمعدل النمو وقياسات الجلوكوز المتوسطة لتقدير معدل التغذية المطلوب للحفاظ على تركيز الجلوكوز المطلوب في المزرعة. اضبط سرعة المضخة بناء على معدل التغذية المحسوب. كرر حساب معدل التغذية واضبط سرعة المضخة لكل نقطة أخذ عينات.

يتم عرض قياسات الجلوكوز المتوسطة من الثقافات الكروية Beta-TC6 insuloma باستخدام المفاعلات الحيوية المعلقة المقلوبة الساكنة ، وطرق زراعة المفاعل الحيوي المعلق باستمرار التغذية بوسط قياسي عالي الجلوكوز. التغذية المستمرة قادرة على القضاء على تقلبات الجلوكوز ، لكن متوسط مستويات الجلوكوز في الوسط يتغير بشكل كبير خلال فترة الاستزراع ، وهو أعلى بكثير من النطاق الفسيولوجي.

التغذية المعدلة قادرة على القضاء على التقلبات ، وكذلك الحفاظ على تركيزات الجلوكوز بالقرب من المستويات الفسيولوجية طوال فترة الثقافة. هنا ، تمت مقارنة نمو الخلايا الذي تم الإبلاغ عنه على أنه تغيير في عدد الخلايا خلال فترة الزراعة البالغة 21 يوما للمفاعلات الحيوية المعلقة المقلوبة مع التغيرات المتوسطة المنتظمة ، ومعدل التغذية الثابت لمزارع المفاعلات الحيوية المعلقة ، ومعدل التغذية المعدل بثقافات المفاعلات الحيوية المعلقة. باتباع هذا الإجراء ، يتم إعداد طرق أخرى مثل الظروف المتغيرة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل متطلبات المغذيات لخطوط الخلايا الجديدة ، أو النتائج التجريبية المحددة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف متطلبات التمثيل الغذائي في الخلايا من البشر المصابين بالسرطان أو اضطرابات أخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع نظام زراعة الخلايا الغزيرة للتحكم بشكل أفضل في ظروف الثقافة وزيادة إنتاجية الخلايا. لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل الحماية من مسببات الأمراض المنقولة بالدم أثناء تنفيذ هذا الإجراء.