التقطير السريع وعزل مكونات الدم الكامل في عينات تم الحصول عليها من إعداد المجتمعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير بروتوكول مبسط يتيح إنتاجية العين السريعة ، والمعالجة المتزامنة لعينات الدم الكاملة. في بيئة غير سريرية ، يتم إجراء معالجة الفراغ بطريقة متداخلة لتمكين العزل الفعال للأجزاء عالية الجودة من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة أو مصل PBMC والأجزاء المتبقية من البلازما وخلايا الدم الحمراء. تبدأ المعالجة بالطرد المركزي لجهاز التفريغ المصلي ، وإزالة كمية من فك واحد يحتوي على فراغ للطرد المركزي لعزل الحمض النووي للأنابيب الفيالية.

ثم يمكن أن يحدث الانتهاء من عزل الحمض النووي بعد عزل الكريات البيض المشتقة من الحمض النووي الريبي من K two EDTA vacutainer. يتم تمرير الدم من كل فراغ من خلال مرشح خاص وغسله باستخدام PBS ، ثم يعالج بعامل تثبيت الحمض النووي الريبي الذي يعود إلى القرص الذي يحتوي على الفراغ. يتم سحب البلازما المتبقية وغسل الطبقة أحادية النواة باستخدام PBS.

أثناء دوران الأنابيب ، يتم جمع خلايا الدم الحمراء المتبقية ويكون المصل المنفصل عبارة عن حصة. أخيرا ، يتم الحفاظ على pbmc في وسط تجميد الخلايا. في النهاية ، يمكن إنتاج أجزاء عالية الجودة من الدم الطازج في غضون ساعتين من الجمع ويمكن أن تتوفر جميع العينات الجاهزة للفحص في غضون يومين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه يمكن تنفيذ الإجراءات في وقت واحد في بيئة غير سريرية ، وبالتالي إنتاج مواد أولية في غضون يومين للعديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك تحليلات الميكروصفيف اللاجيني في الوقت الحقيقي R-T-P-C-R وقياس التدفق الخلوي. سيتم توضيح الإجراء إيمي ويكل ، مديرة مختبري لبدء معالجة عينة الدم الكاملة. تأكد من تجهيز المخازن المؤقتة وأجهزة الطرد المركزي والكتلة الحرارية.

قم بتوثيق وقت تسليم المكنسة الكهربائية على ورقة تتبع العينة. بعد استلام العينات ، قم بتوثيق عزل المصل. بدء وقت البدء في سجل العينة على الفور ، ابدأ المعالجة عن طريق الطرد المركزي للمكنسة الكهربائية المصل سعة سبعة ملليلتر مع إيقاف تشغيل الفرامل والتسارع.

استخدام دوار دلو متأرجح مع أغطية بخاخ لمدة 20 دقيقة عند 1300 GS أربع درجات مئوية أثناء الطرد المركزي لجهاز التفريغ في الدم. قم بتوثيق وقت بدء عزل الحمض النووي في غطاء ثقافة خليتين BSL. اقلب حاويات الفراغ التي تحتوي على هلام المقارير خمس مرات وأضف 200 ميكرولتر من الدم الكامل من أعلى أحد المكنسة الكهربائية إلى كل من حصتين من البروتيازات سعة 20 ميكرولترا.

اترك البروتياز وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة للدم في غطاء المحرك واستمر في الطرد المركزي للمكالمة التي تحتوي على حاويات فراغ. قبل الطرد المركزي. توثيق وقت بدء عزل PBMC ، والذي يجب أن يكون في غضون ساعتين من سحب الدم.

اقلب مكالمة FI التي تحتوي على حاويات فراغ بالفعل في حاويات الهباء الجوي الضيقة من ثماني إلى 10 مرات. ثم قم بالطرد المركزي للمكنسة الكهربائية مع الانقطاع والتسارع لمدة 30 دقيقة عند 1600 جي 22 درجة مئوية. ارجع إلى عينات عزل الحمض النووي في غطاء المحرك وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت إلى كل من أنابيب البروتياز وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة للدم.

قم بتغطية الأنابيب وإزالتها من الغطاء. ثم دوامة لهم لمدة 15 ثانية. بعد الدوامة على الفور ، قم بتدوير العينات.

تابع عزل الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب حتى يتم التلميح إلى الحمض النووي من العمود على Ellucian. تجميع الحمض النووي من العمودين لكل مشارك للحصول على عائد إجمالي قدره 800 ميكرولتر لكل مشارك. توثيق وقت بدء عزل الحمض النووي الريبي للكريات الكريات البيض.

اخترق الحاجز المطاطي للمكنسة الكهربائية K two EDTA بارتفاع النقل. احتفظ بالغمد والغطاء اللولبي لاستخدامه لاحقا بعد تجميع نظام أنبوب K two EDTA. استخدم نهاية الملعقة المعدنية لفك الإبرة بأمان وإدخال الإبرة في أنبوب جمع دم فارغ سعة 10 ملليلتر.

اقلب مجموعة أنبوب استقبال مرشح الفراغ K two EDTA لإكمال الإعداد بعد الترشيح وغسل A PBS ، اسحب ثلاثة ملليلتر من عامل تثبيت الحمض النووي الريبي باستخدام حقنة جديدة سعة 10 ملليلتر. اغسل الفلتر مع التأكد من بقاء عامل تثبيت الحمض النووي الريبي متصلا. ثم افصل المحقنة عن الفلتر دون سحب المكبس.

أغلق مدخل ومخرج المرشح باستخدام الغلاف والغطاء اللولبي المحتفظ به من مسمار النقل واترك المرشح مشبعا بعامل تثبيت الحمض النووي الريبي. قم بتخزين الفلتر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعتين على الأقل حتى يسمح الوقت باستكمال عزل التهاب المفاصل الروماتويدي. بمجرد إعادة المكنسة الكهربائية إلى غطاء محرك BSL الثنائي ، قم بإزالة السدادة واستخدم ماصة مصلية لسحب 1.5 مل من طبقة البلازما العلوية دون الاقتراب من الطبقة أحادية النواة.

انقل البلازما من المكنسة الكهربائية إلى قارورة التبريد سعة خمسة ملليلتر. ثم قم بتسجيل وحدة التخزين التي تم جمعها. انقل البلازما المتبقية والطبقة أحادية النواة باستخدام ماصة مصلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

ثم أضف ما يكفي من XPBS المعد مسبقا ليصل الحجم الإجمالي في الأنبوب المخروطي إلى 15 ملليلترا. قم بتغطية الأنبوب واقلبه خمس مرات. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب مع الانقطاع والتسارع لمدة 15 دقيقة عند 300 GS 22 درجة مئوية.

ارجع إلى القار الذي يحتوي على حاويات فراغ في الغطاء واجمع خلايا الدم الحمراء أو كرات الدم الحمراء. استخدم ماصة باستير بحجم خمسة وثلاثة أرباع بوصات للدوران حول طبقة هلام الميثير وفكها وإزالتها. استخدم ماصة مصلية لجمع كرات الدم الحمراء ونقلها إلى قارورة تبريد سعة خمسة ملليلتر.

ثم قم بتسجيل وحدة التخزين. بعد ذلك ، انقل قوارير البلازما وكرات الدم الحمراء المجمدة إلى حاوية تجميد ذات معدل متحكم فيه وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة على الأقل. بعد 24 ساعة ، انقل العينات إلى صندوق التبريد وأعدها إلى 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل.

عند اكتمال الطرد المركزي ، أعد الأنبوب المخروطي إلى غطاء المحرك وشفط السائل ، تاركا 500 ميكرولتر من PBS دون إزعاج الحبيبات. أضف XPBS واحد لرفع الحجم إلى 10 ملليلتر وإعادة تعليق الحبيبات. قم بتغطية الأنبوب برفق واقلبه خمس مرات.

ثم قم بالطرد المركزي للعينة باستخدام الفرامل وإيقاف التسارع لمدة 10 دقائق عند 300 GS 22 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بتقسيم طبقة المصل العلوية من المكنسة الكهربائية إلى قارورتين بالتبريد مليلتر وتوثيق الحجم. استخدم أربع قوارير بالتبريد وقم بنقل 200 ميكرولتر في قارورة التبريد.

واحد 1000 ميكرولتر في قارورة التبريد اثنين. ثم قسم الحجم المتبقي إلى قوارير التبريد ثلاثة وأربعة. انقل قوارير التبريد إلى صندوق التبريد واحتفظ بها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل.

وتوثيق وقت بدء الفريزر. استمر في عزل PBMC. عند إعادة العينات إلى غطاء المحرك بعد الطرد المركزي ، قم بشفط أكبر قدر ممكن من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.

نعلق الحبيبات في 2.5 مل من PBMC. متوسط واحد. أضف 2.5 مل من PBMC ، وتجميد وسط اثنين يحتوي على DMSO و RPMI.

متوسط إلى محلول الخلية المعد مسبقا ، ودوامة العينة برفق. ثم قم بنقل 10 ميكرولتر من محلول الخلية في أنبوب طرد مركزي صغير. أضف 10 ميكرولتر من وصمة عار زرقاء 0.4٪ في أنبوب الطرد المركزي الصغير واخلط المحلول عن طريق سحب العينة عدة مرات.

بعد ذلك ، قم بوضع 10 ميكرولتر من الخليط في غرفة عد الخلايا. حرك الشريحة وضعها في عداد الخلايا في غضون ثلاث دقائق من الخلط. قم بالتكبير والتركيز على الخلايا.

ثم حدد عدد الخلايا للحصول على عدد A-P-B-M-C. إذا كان رقم PBMC القابل للحياة أعلى من 3 ملايين خلية لكل مليلتر ، فقم بتقسيم العينة إلى خمس قوارير تبريد كحد أقصى بتركيز لا يقل عن 3 ملايين خلية لكل مليلتر. كل وثيقة عدد الخلايا لكل قارورة تبريد في سجل العينة.

راجع بروتوكول النص المصاحب لمعرفة كيفية المتابعة إذا كان رقم PBMC القابل للتطبيق أقل من 3 ملايين خلية لكل مليلتر. أخيرا ، انقل قوارير التبريد إلى حاوية تجميد ذات معدل متحكم فيه وضعها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة على الأقل. بعد 24 ساعة ، انقل قوارير التبريد إلى صندوق التبريد وضع الصندوق في مرحلة بخار خزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

قم بتوثيق وقت بدء الفريزر في سجل العينات. أسفرت طرق عزل الحمض النووي الريبي للكريات البيض ومعالجة المرشح عن هذه الصورة الهلامية الناتجة عن الرحلان الكهربائي الشعري. تم إنتاج شريطين متميزين مع الحد الأدنى من التدهور يمثلان ATT s و 28 ثانية من الحمض النووي الريبي الريبوزي.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الحفاظ على سجلات دقيقة أمر بالغ الأهمية. نوصي بتطوير قاعدة بيانات لتخزين جميع معلومات قارورة التبريد ، بما في ذلك الحجم والتركيز والجودة والرمز الشريطي وموقع التخزين في البداية. ويمكن العثور على مزيد من التوصيات حول تنظيم العينة في بروتوكول النص.