التدفق الخلوي بروتوكولات لالسطحية وبين الخلايا مستضد تحليلات العصبية أنواع الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل التعبير عن المستضدات السطحية وداخل الخلايا على الخلايا العصبية باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الخلايا العصبية أولا من الثقافات المختبرية أو الأنسجة العصبية الأولية. بعد ذلك ، يتم تطبيق صبغة اختيارية غير محددة داخل الخلايا على الخلايا.

ثم يتم تصنيف المستضدات السطحية المرغوبة على الفور بجسم مضاد أساسي ، بينما يتم تصنيف المستضدات داخل الخلايا المرغوبة بعد التثبيت الخلوي والتغلغل. في النهاية ، يمكن الحصول على النتائج باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي للتعبير المشترك عن المستضدات السطحية على مجموعات سكانية فرعية عصبية محددة ذات أهمية كما هو محدد بواسطة الملصق داخل الخلايا. سيوضح هذا البروتوكول كيفية تحضير الخلايا العصبية المشتقة من زراعة الأنسجة لاستجواب المستضدات السطحية وداخل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان.

لبدء الحصاد ، الخلايا العصبية الملتصقة المزروعة في قوارير T 75 عن طريق غسل الخلايا برفق أولا مرة واحدة بخمسة ملليلتر من المغنيسيوم والبوليزومات الخالية من الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة. ثم افصل الخلايا عن القارورة بإضافة ثلاثة ملليلتر من بديل التربسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. قم بإخماد الهضم الأنزيمي عن طريق إضافة ستة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق بعد فك كتل الخلايا عن طريق سحب تعليق الخلية لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ونقل تعليق الخلية بالكامل إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر لعزل الخلايا.

ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي ، وقم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وشفط snat استعدادا لوضع العلامات على الصبغة داخل الخلايا. أعد تعليق حبيبات الخلية بخمسة ملليلتر من PBS بالإضافة إلى 0.1٪ BSA. خلاف ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق جنبا إلى جنب مع بروتوكول تلطيخ اللون الأزرق القياسي.

استخدم مقياس الخلوي الدموي لتقدير عدد الخلايا الفعال القابل للحياة. أعد ضبط تركيز الخلية للتعليق الموجود إلى 1 مليون خلية قابلة للحياة لكل مليلتر بنفس المخزن المؤقت المستخدم في الخطوة السابقة. هذه الخلايا جاهزة الآن لخيارين للتلوين ، أو صبغة الجسم المضاد للمستضد السطحي ، أو صبغة فلورية اختيارية داخل الخلايا مع فلوريسين الكربوكسي متبوعة بصبغة المستضد السطحي المذكورة أعلاه.

لتنفيذ خطوة وضع العلامات داخل الخلايا باستخدام صبغة إستر الكربوكسي فلوريسين CIN ، أضف أولا 10 ميكرولترات من محلول مخزون CFSE. لكل مليلتر واحد من تعليق الخلية ، ضع الأنبوب على شاكر بسرعة 200 دورة في الدقيقة واحتضن الخليط لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، امنع التبييض الضوئي عن طريق حماية الأنبوب من التعرض المباشر للضوء.

قم بإخماد جميع الأصباغ غير التفاعلية عن طريق إضافة خمسة كميات من المصل الذي يحتوي على عازل التدفق والماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط. ثم قم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي بدرجة حرارة الغرفة وشفط المادة الطافية لإزالة الآثار المتبقية من الأصباغ غير التفاعلية. اغسل حبيبات الخلية عن طريق تعليقها بخمسة أحجام من المخزن المؤقت للتدفق.

ثم يتم تدوير الخلايا مرة أخرى في جهاز طرد مركزي بدرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل التخلص من SUP natant. أخيرا ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية باستخدام المخزن المؤقت للتدفق بحيث يكون التركيز النهائي للخلية 1 مليون خلية قابلة للحياة لكل مليلتر. لتجربة متعددة الإرسال ، أضف عددا متساويا من الخلايا غير الملوثة ذات الأهمية من حالة تجريبية مختلفة إلى تعليق الخلايا الملونة CFSC.

الخلايا جاهزة الآن لوضع علامات على المستضد السطحي بالأجسام المضادة لبدء تلطيخ سطح الخلية. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية مع أو بدون ملصقات CFSC إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف الفلور أربعة أجسام مضادة مترافقة إلى معلق الخلية بكمية محددة مسبقا بواسطة اختبارات معايرة الأجسام المضادة.

ضع الأنبوب على شاكر مداري بدرجة حرارة الغرفة عند 100 دورة في الدقيقة واحتضن الخليط لمدة 30 دقيقة. في حالة عدم وجود ضوء ، قم بتخفيف خليط الأجسام المضادة بإضافة مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتدفق. قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا وتدويرها في جهاز طرد مركزي دقيق أربع درجات مئوية مبرد مسبقا لمدة أربع دقائق.

استنشق supinate لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة وكرر جهاز الطرد المركزي والشفط هذا. خطوة مرة أخرى. يقوم Reus بتعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر ، وهو مخزن مؤقت للتدفق إلى الخلايا الملطخة سابقا.

أضف 500 ميكرولتر من مخزن التثبيت المؤقت إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. ضع الأنبوب على شاكر مداري بدرجة حرارة الغرفة عند 100 دورة في الدقيقة واحتضنه لمدة 15 دقيقة في الظلام. سوف يربط الفورمالديهايد جميع أنواع البروتين والحمض النووي التي تقع على مقربة من بعضها البعض وينتج عنه معلقات خلوية غير قابلة للحياة.

خفف خليط التثبيت بإضافة مليلتر واحد من PBS والماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط. ثم قم بتدوير الخلايا الثابتة في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا بأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق. استنشق supinate بحيث يبقى 100 ميكرولتر من السائل فوق حبيبات الخلية لاختراق غشاء الخلية لوضع العلامات اللاحقة على المستضد داخل الخلايا.

أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. ضع الأنبوب على شاكر مداري بدرجة حرارة الغرفة عند 100 دورة في الدقيقة واحتضنه لمدة 15 دقيقة في الظلام. قم بتخفيف خليط النفاذية عن طريق إضافة مليلتر واحد من ماصة PBS برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط الخلايا الثابتة وتدويرها في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا بأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.

استنشق SUP natant تماما قبل الحضانة. قم بإعداد مخزون عمل أولي للأجسام المضادة عن طريق تخفيف الجسم المضاد في PBS بالإضافة إلى 0.5٪ tween 20 عازلة. يتم إثراء ذلك إما بمصل حمار 1٪ BSA 10٪ أو مصل ماعز بنسبة 10٪.

ثم أعد تعليق حبيبات الخلية القابلة للاختراق للغشاء مع 100 ميكرولتر من مخزون عمل الجسم المضاد الأساسي. ضع الأنبوب على شاكر مداري بدرجة حرارة الغرفة عند 200 دورة في الدقيقة واحتضنه لمدة 30 دقيقة في الظلام. قم بتخفيف خليط الأجسام المضادة الأولية بإضافة مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتدفق.

قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط الخلايا وتدويرها في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا بأربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق. استنشق السوبينات تماما لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات ب 100 ميكرولتر من مخزون عمل الجسم المضاد الثانوي.

كرر حضانة درجة حرارة الغرفة المحمية بالضوء لمدة 30 دقيقة. في نفس شاكر ، قم بتخفيف خليط الجسم المضاد الثانوي بإضافة مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتدفق. كرر نفس خلط انعكاس الأنبوب ، والدوران لأسفل وإزالة المادة الطافية للتخلص من جميع الأجسام المضادة غير المرتبطة.

كرر نفس خطوات الطرد المركزي للغسيل والمليلتر وإزالة المواد الطافية مرتين إضافيتين ، ولكن مع PBS الطازج كمخزن مؤقت للغسيل. بدلا من ذلك ، ستكون النتيجة النهائية عبارة عن حبيبات خلية نظيفة مصنفة إما بالأجسام المضادة الفلورية المستهدفة خارج الخلية أو داخل الخلايا CFSC أو أي مجموعات من التعليق الثلاثة ، حبيبات الخلية المسماة في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق. انقل تعليق الخلية إلى مقياس التدفق الخلوي وابدأ التحليل باستخدام إعدادات مرشح الإثارة والانبعاث بالليزر المناسبة لكل طابق من أربعة.

باستخدام بيانات التشتت الأمامية والجانبية كدليل ، قم بإعداد التشتت الأمامي الأولي مقابل التشتت الجانبي داخل برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي لاستبعاد نقاط البيانات غير المحددة مثل حطام الخلية والخلايا الميتة. بعد ذلك ، باستخدام البيانات الأولية من تعليق الخلية غير الملوثة كعنصر تحكم سلبي ، قم بإعداد بوابات تكامل فلورية متعددة تحدد إشارات الانبعاث الإيجابية من كل من ملصقات المستضد خارج الخلية وداخل الخلايا لحساب فلورسنت الخلفية من متعدد الألوان. تعيد تأثيرات التداخل الطيفي ضبط بوابات الفلورسنت باستخدام البيانات الأولية من عناصر التحكم الملطخة بالجسم المضاد الفردي.

في تجربة الفاكس متعددة الإرسال ، يمكن استخدام علامات الفلورسين الكربوكسي كإشارة أساسية يمكن أن تميز بين الخلايا من سلالتين مختلفتين أو ظروف تجريبية دون استخدام جسم مضاد. على سبيل المثال ، في تعليق الخلية غير المتجانسة ، يمكن للمرء أن يميز على الفور بين الخلايا العصبية الموسومة ب CFSC مقابل الخلايا الليفية غير الموسومة بمجرد النظر إلى وجود أو عدم وجود مضان في القناة الخضراء. علاوة على ذلك ، بالاقتران مع وضع العلامات على CFSE Esther ، يمكن للمرء استخدام الأجسام المضادة الفلورية بألوان مختلفة لتحديد التعبير التفاضلي للمستضدات السطحية بين CFSE المسمى مقابل المجموعات الفرعية غير المسماة داخل عينة مختلطة.

على سبيل المثال ، SHSY خمسة خلايا الورم الأرومي العصبي Y المسمى CFSE في قناة التألق الأخضر ، تعبر عن مستويات عالية من مستضد سطح CD 24 ، ولكن ليس من علامة الخلايا الليفية CD 54. في المقابل ، فإن الخلايا الليفية السلبية ل CFSC BJ إيجابية ل CD 54 مع مستويات أقل من CD 24. يمكن أيضا إجراء تحليل المستضدات السطحية العصبية جنبا إلى جنب مع الكشف القائم على الأجسام المضادة للمستضدات داخل الخلايا.

يعد إدراج عينات غير ملطخة وضوابط ملطخة مفردة للمستضدات السطحية والمستضدات داخل الخلايا أمرا بالغ الأهمية كبديل لوضع العلامات الأولية والثانوية القائمة على الأجسام المضادة للمستضدات داخل الخلايا مثل خريطة العلامة العصبية الثانية الموضحة هنا. يمكن أن يؤدي وضع العلامات الفلورية غير التساهمية للجسم المضاد الأساسي إلى نتائج قابلة للمقارنة في تحليل التعبير المشترك وتقصير البروتوكول. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الخلايا العصبية لتحليل التدفق الخلوي الأساسي باستخدام العديد من أساليب وضع العلامات البديلة ومجموعات منها.