تقييم خصائص الخلايا الجذعية في الإنسان خلايا سرطان المبيض عن طريق متعدد واحدة على أساس خلية المجالات فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم خصائص الخلايا الجذعية لخلايا سرطان المبيض البشري باستخدام فحوصات متعددة وخلايا مفردة. يتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار SOX اثنين من المراسلين RFP الخلايا المنقولة عن طريق علاج Pur Mycin في الخطوة الثانية ، يتم عزل الخلايا الإيجابية RFP والخلايا السلبية RFP وطلاءها بالحقائق كمستعمرات أحادية أو متعددة الخلايا لكل بئر. بعد ذلك ، يتم تحليل تكوين الكرة الأولية مجهريا ثم يتم فصل ثقافات الكرة الأولية وإعادة طلاءها لتحليل تكوين الكرة الثانوية.

في النهاية ، تستخدم فحوصات المجال هذه لحساب نسبة الخلايا الجذعية المفترضة لسرطان المبيض التي تظهر قدرة تشكيل الكرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية السرطانية ، مثل ما هي بعض مجموعات الخلايا الجذعية السرطانية المحتملة وما هو التردد في كيس الورم بأكمله. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتحديد الخلايا الجذعية لسرطان المبيض ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من كيانات الورم الصلبة الأخرى مثل سرطان الثدي.

بعد 24 ساعة من تحويل خلايا سرطان المبيض البشري بجزيئات الفيروسية ، قم بإزالة المادة الطافية الفيروسية وغسل الخلايا في مزرعة PBS. الخلايا في وسط كامل لمدة 48 ساعة. ثم قم بتغيير الوسيط وأضف 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من بيرو مايسين بعد خمسة أيام.

عالج الثقافات بالدرع الأول عند التخفيف من واحد إلى 1000 في اليوم التالي. اغسل الخلايا في PBS ثم افصلها باستخدام 0.05٪ tripsin EDTA. بعد ثلاث دقائق ، أوقف التفاعل بوسط كامل.

عد الخلايا وقم بطردها المركزي لمدة خمس دقائق عند 300 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا بعناية في 0.5 إلى مليلتر واحد من PBS المعقم ثم قم بتصفية معلق الخلية الناتج من خلال مرشح 40 ميكرومتر. اضبط الخلايا على خمسة في 10 إلى الخلايا الست لكل تخفيف مليلتر ، ثم أضف 100 ميكرولتر من الكرات المتوسطة إلى كل بئر من لوحة 96 بئر مرفق منخفض للغاية بجانب مقايسة كرة قائمة على خلية واحدة.

استخدم وضع الخلية المفردة لفرز خلية واحدة في كل بئر من اللوحة. ثم قم بتسجيل الخلايا مجهريا لتقييم كفاءة الطلاء. احتضان الخلايا في مجالات جديدة ، متوسطة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي اليومي ومكملات عامل نمو البشرة.

بعد أسبوع واحد ، حدد عدد مجالات الورم الناشئة عن طريق المجهر الضوئي ووجود إشارة الفلورسنت من نظام مراسل متكامل بواسطة المجهر الفلوري. احسب الكرات التي يزيد قطرها عن 100 ميكرومتر على أنها كرات كبيرة والكرات التي يتراوح قطرها من 50 إلى 100 ميكرومتر على أنها كرات صغيرة. الحرص على حساب المجالات الحقيقية وليس مجموعات الخلايا.

ثم احسب نسبة الكرة التي تشكل الخلايا الموجبة لطلب تقديم العروض أو خلايا سالبة RFP وفقا لصيغة المرور. تبدأ الكرات بنقل محتويات كل بئر إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 ملليلتر. ثم اشطف كل بئر ثلاث إلى خمس مرات باستخدام PBS للتأكد من جمع كل الكرات وتدوير الخلايا لمدة 10 دقائق عند 300 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة snat وتعليق الكريات في 200 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسفي EDTA عند 37 درجة مئوية في شاكر ناعم لمدة خمس دقائق. إذا لم تكن هناك كرات كبيرة مرئية بعد خمس دقائق، فقم بتقشير محلول الخلية برفق باستخدام طرف ماصة سعة 100 ميكرولتر وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل لتعطيل التربسين. قم بتدوير الخلايا بإعادة تعليق الكريات بعناية في وسط الكرات واستنزاف تعليق الخلية الناتج من خلال مرشح 40 ميكرومتر كما تم تصنيفه للتو.

أخيرا ، لإعادة الطلاء التسلسلي للخلايا المفردة ، قم بزرع خلايا مفردة من كرة أولية واحدة في 100 ميكرولتر من الكرات ، متوسطة لكل بئر في لوحة 96 بئر جديدة منخفضة للغاية. ثم استخدم نفس الصيغة المستخدمة في مقايسة المجالات الأولية لتقييم نسبة الخلايا المكونة للكرة في المجالات الثانوية. فحوصات في المجالات متعددة الخلايا ، مما أدى إلى ما يقرب من 40٪ من خلايا سرطان المبيض البشري الإيجابية RFP مقارنة ب 20٪ فقط من الخلايا السلبية RFP إلى ظهور كرة ورم فردية في فحص المجالات الأولية.

والمثير للدهشة أنه يتم حساب أعداد أكبر من المجالات من أعداد أقل من الخلايا المطلية في كل من الوسائط المستندة إلى MGEM و D-M-E-M-F 12 مما يدل على أن طرق الطلاء متحيزة للغاية للنتائج في هذا الفحص. في المقابل ، عندما يتم تثبيت الخلايا عن طريق إضافة 1٪ ميثيل السليلوز ، تكون كفاءة تكوين الكرة مستقلة في الغالب عن كثافة الخلايا في مزارع الكرات متعددة الخلايا. ما يقرب من 35٪ من الخلايا من المجالات الموجبة لطلب تقديم العروض تفقد إشارة الفلورسنت الحمراء بعد سبعة أيام من الثقافة ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا قد خضعت للتمايز بينما تحتفظ أكثر من 65٪ من الخلايا بإشارة RFP مما يشير إلى قدرة التجديد الذاتي.

في المقابل ، تظل الخلايا من المجالات المتولدة من الخلايا السلبية لطلب تقديم العروض في البداية سلبية ، مما يشير إلى أنها لا تستطيع إعادة إنشاء إمكانات الخلايا الجذعية في ظل هذه الظروف. يؤكد الفحص المجهري الفلوري الذي يتم إجراؤه على الكرات المتولدة من خلايا مفردة هذه البيانات مما يدل على أن المجالات المفردة المشتقة من الخلايا الموجبة لطلب تقديم العروض تحتوي على خلايا إيجابية RFP وسالبة RFP. في حين أن الكرات المشتقة من الخلايا السالبة RFP تحتفظ بافتقارها إلى الإشارة الحمراء باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء الميئرات الأخرى مثل الأجسام المضادة أو التلوين أو تحليل التعبير الجيني عن طريق PCR الكمي لتوصيف الخلايا ذات القدرة الشديدة على التكوين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب إجراء فحوصات الزرع في الجسم الحي في الفئران المثبطة للمناعة للتحقق من صحة خصائص الخلايا الجذعية للورم في الخلايا التي تبدأ الكرة الخلايا.