بوساطة التنبيب داخل الرغامى (IMIT) تقطير: وموسع والرئة محدد نظام تسليم

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيل البكتيريا مباشرة إلى رئتي الفئران بشكل غير جراحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل وسادة هوائية سعة 150 ميكرولتر أولا في حقنة محكمة للغاز ، متبوعة ب 50 ميكرولترا من التعليق البكتيري المجهز. في الخطوة الثانية ، يتم تنبيب الفأر المخدر بقسطرة قياس 20 باستخدام سلك توجيه للمساعدة في التنسيب.

ثم بعد التأكد من نجاح التنبيب باستخدام مقياس تدفق بسيط ، يتم توصيل اللقاح البكتيري من خلال القسطرة مباشرة إلى الرئة بإبرة حادة طويلة 22 مقياسا. في النهاية ، يمكن استخدام التنبيب بوساطة القصبة الهوائية أو التلقيح الحذف لدراسة أمراض الجهاز التنفسي السفلي في الفئران ، وتجنب التورط المتزامن للجهاز التنفسي العلوي. الميزة الرئيسية ل imit على طرق التلقيح بين الأنف هي أن هذه التقنية تسمح بتوصيل اللقاح بدقة وقابلة للتكرار مباشرة إلى الرئتين.

نظرا لأن IIT هي تقنية غير جراحية ، فإنها تقلل أيضا من احتمالية حدوث مضاعفات مرتبطة بالإجراءات الجراحية داخل القصبة الهوائية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر آلية موثوقة لتوصيل البكتيريا إلى الرئة لدراسة التسبب في المرض ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيق IMA على توصيل الكواشف الأخرى ، مثل المركبات البيئية لدراسة تلف الرئة ، والتسليم المستهدف للعلاجات لعلاج وتسليم مجسات التصوير أو SRNA لدراسة بيولوجيا الرئة الأساسية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع خطوة التنبيب لأن الخطوة تتطلب وضعا دقيقا للحيوان ومنظارا تلقائيا لإدخال سلك التوجيه.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا حيث يصعب من الناحية المفاهيمية وصف الوضع الأولي للسلك التوجيهي في القصبة الهوائية للباحثين الجدد. قبل 15 ساعة من التثبيت ، قم بتلقيح ثلاثة ملليلتر من ثقافة المرق بمستعمرة بكتيرية واحدة وقم بزراعة الثقافة عند 37 درجة مئوية وشاكر عند 200 دورة في الدقيقة. بعد 15 ساعة ، قم بتدوير مليلتر واحد من الخلايا في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مليلتر ، وأعد تعليق الحنك في مليلتر واحد من PBS.

بعد ذلك ، قم بقياس تخفيف من واحد إلى 10 من تعليق المخزون البكتيري عند OD 600 لتحديد تركيز البكتيريا. ثم قم بتخفيف الخلايا البكتيرية في PBS إلى التركيز المطلوب من البكتيريا لكل 50 ميكرولتر من اللقاح. لتركيب IIT ، يتم تحضير الفئران ل IIT عن طريق إعطاء محلول ليدوكائين بنسبة 2٪ للفأر المخدر قليلا بواسطة الفئران ذات الإبرة المتزوية.

العودة إلى التخدير أثناء سريان الليدوكائين. الآن اسحب 150 ميكرولترا من الهواء في حقنة إلغاء من نوع الغاز سعة 250 ميكرولتر ، ومجهزة بإبرة حادة طويلة قياس 22. ثم قم بتقديم مكبس التفلون من علامة 150 ميكرولتر إلى علامة 200 ميكرولتر على جسم المحقنة لسحب 50 ميكرولترا من اللقاح البكتيري عند تحميل المحقنة.

لوس أنجلوس ، فأر مخدر مستلق على منصة تنبيب تثبت بواسطة القواطع الموجودة على حلقة غير متصلة بشريط فيلكرو متصل بالمنصة. ارفع الماوس إلى منحدر 45 درجة ثم استخدم قضيب قطني صغير لسحب اللسان بحركة متدحرجة باليد المهيمنة. بعد ذلك ، باستخدام اليد غير المهيمنة ، استخدم منظار الأذن التشغيلي المناسب مع منظار التنبيب للحفاظ على تراجع اللسان وتصور لسان المزمار.

ثم أمسك بسلك توجيه مربوط عبر قسطرة قياس 20 في اليد المهيمنة ، وقم بتنبيب الماوس إلى عمق 10 ملم داخل القصبة الهوائية وإزالة منظار الأذن. قم بتأمين القسطرة باليد غير المهيمنة. ثم نعلق لفترة وجيزة طول مغري متصل من 16 أنبوب شفاف يحتوي على صبغة ملونة إلى القسطرة.

يجب أن تهاجر الصبغة بسرعة ذهابا وإيابا استجابة لتنفس عندما يتم تنبيب بنجاح. أدخل الإبرة الحادة قياس 22 في القسطرة وقم بتوزيع اللقاح مباشرة في الرئة بحركة سائلة واحدة. ثم قم بإزالة الإبرة والقسطرة على الفور من وأعد الفأر إلى قفصه مع المراقبة حتى يتعافى تماما من التخدير.

لتقييم العبء البكتيري لأنسجة الرئة المصابة، قم بإزالة الرئتين باستخدام تقنية معقمة وضع الأنسجة في كيس عينة معقم بوزن أونصة واحدة. بعد وزن كيس العينة بالإضافة إلى الرئتين ، أضف ملليلترا واحدا من PBS المعقم إلى الأنسجة وأعد بيع كيس العينة. ثم قم بلف ماصة مصلية سعة 25 مل برفق فوق كيس العينة لتجانس الأنسجة.

قم بإزالة الأنسجة المتصلة من خلال مرشح مسار جدار بوليستر معقم ومعالجة التجانس باستخدام tritton X 100 بتركيز نهائي قدره 1٪ لتحرير البكتيريا. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لإجراء تخفيف تسلسلي ستة أضعاف للتجانس في لوح بئر UBO 96. ثم استخدم ثماني آبار متعددة القنوات للوحة ثلاثية النسخ المتجانسة 10 ميكرولتر على لوحة أجار LBA.

أخيرا ، احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية وعدد وحدات تشكيل المستعمرة في اليوم التالي. يعد توصيل البكتيريا بكفاءة عالية عبر هذه الطريقة حيث تم استرداد أكثر من 98٪ من لقاح الزائفة الهوائية من رئتي المغرسة في هذه التجربة التمثيلية. علاوة على ذلك ، فإن تركيب IIT قابل للتكرار بدرجة كبيرة بغض النظر عن تركيز اللقاح الذي يتم إعطاؤه.

لتصور توزيع المادة المغرسة عبر طريقة IIT ، يمكن توصيل 50 ميكرولترا من صبغة Kumasi الزرقاء اللامعة 0.1٪ إلى الرئتين كما هو موضح للتو للتلقيح. لاحظ أن توزيع الصبغة على جميع فصوص الرئة بمجرد إتقانها. يمكن تنفيذ هذه الطريقة بسرعة مع فريق من باحثين في متوسط وقت من دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، بما في ذلك التخدير وتلقيح IMA والتعافي من التخدير.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم عدم القيام بأكثر من محاولتين فاشلتين لتنبيب الفأر. قد يؤدي التنبيب الفاشل إلى صدمة محتملة من إدخال القسطرة في المريء بدلا من القصبة الهوائية. يمكن توصيل العديد من مسببات الأمراض التنفسية ، بما في ذلك تلك التي تتطلب احتواء عضلات البطن L الثلاثة بشكل فعال بواسطة IMED حيث يمكن تنفيذ هذا الإجراء كما هو موضح في خزانات السلامة بالإضافة إلى الباحثين الذين يرتدون حماية تنفسية كاملة بما في ذلك واقي الوجه.

لقد أثبتنا أن imit هي طريقة دقيقة وفعالة للغاية لتوصيل المواد مباشرة إلى رئتي الفئران. هذه الخصائص تجعل imit مناسبا تماما لدراسات نوع GLP التي تتطلب أنظمة نموذجية قابلة للتكرار بدرجة كبيرة.