قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس استقرار البروتين داخل الخلايا وخارجها في أجنة أسماك الحمار الوحشي الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع علامات على بروتين الفلورسنت القابل للتحويل بالصور ، وعن طريق حقن mRNA ، وترميز الاندماج بالإضافة إلى صبغة الفلورسنت في أجنة الزرد. بعد ذلك ، يتم تحويل بروتين الانصهار القابل للتحويل بالصورة ، والذي يصنف البروتين النبضي.

في هذا المثال ، يتم إفراز بروتين الاندماج ثم تتم مراقبة الاضمحلال في شدة التألق المحول داخل الخلية وخارجها بمرور الوقت وتزويده بوظيفة متناقصة بشكل كبير من أجل تحديد عمر النصف داخل الخلية وخارج الخلية لبروتين الاندماج. تظهر النتائج الاستقرار في الجسم الحي لبروتينات الاندماج الضوئية القابلة للتحويل بناء على الاضمحلال في إشارة الفلورسنت بمرور الوقت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الخلية وعلم الأحياء التنموي.

على سبيل المثال ، كيف يؤثر الاستقرار على توزيع البروتين وتوافره. نحن نستخدم برنامجنا EP لتحليل بيانات FD DP. EP متاح مجانا على صفحة الويب الخاصة بنا بعد إنشاء mRNA مغطى في ترميز بروتين اندماج قابل للتحويل باللون الأخضر إلى الأحمر ذي الأهمية ، ينقل ما يقرب من 31 أجنة من سمكة الزرد في مرحلة الخلية إلى طبق بتري بلاستيكي مطلي بقطر خمسة سنتيمترات أو طبق بتري بلاستيكي مطلي بالورد يحتوي على ما يقرب من ثمانية ملليلتر من وسط الجنين.

أضف ملليلترين من محلول المرق المعد مسبقا والمذاب إلى الطبق واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. املأ مكبر صوت زجاجي بوسط الجنين ، مع تجنب تعريض الأجنة للهواء أو البلاستيك ، انقل الأجنة إلى الدورق عن طريق إمالة طبق بتري أثناء غمره في الوسط. بعد أن تستقر الأجنة في قاع الدورق ، اسكب معظم الوسط واستخدم وسيطا جديدا لاستبداله بعناية.

سيؤدي الدوران الخفيف للوسط الطازج إلى فقدان الأجنة لقلبتها الضعيفة. بعد تكرار الغسيل ، استخدم ماصة زجاجية من البولي إيثيلين بطرف ملتهب لنقل الأجنة المطلية إلى طبق حقن مغلف بالأغارز. ثم قم بحقن mRNA وثلاثة كيلودالتون Alexa 4 88 DExT Strand مترافقة مباشرة في مركز الخلية لضمان التوزيع المتساوي ل mRNA والصبغة.

بمجرد أن يبدأ الانقسام ، انقل الأجنة المحقونة إلى بئر مغلف بطبقة من واحد إلى 2٪ من طبق بلاستيكي مكون من ستة آبار مملوء بالجنين ، متوسط ، واحتضانه في الظلام عند 28 درجة مئوية حتى تصل الأجنة إلى المرحلة الكروية المتأخرة باستخدام مجهر استريو ، وحدد واحدا إلى خمسة أجنة سليمة واستخدم ماصة زجاجية PEs ذات طرف ملتهب لإزالتها من الطبق. قم بإخراج الأجنة برفق في أنبوب طرد مركزي صغير يحتوي على ما يقرب من ملليلتر واحد من نقطة انصهار منخفضة 1٪ في وسط جنين واحد × دانيوس. بعد ذلك ، اسحب الأجنة مرة أخرى إلى الماصة مع بعض العروق.

ثم اخرج الأجنة والأجنة برفق على الغطاء. كوب من طبق زجاجي القاع. لإعادة استخدام الماصة الزجاجية، قم بتنظيف الأرووس المتبقي لمنع الانسداد عن طريق سحب وسط الجنين بسرعة لأعلى ولأسفل، والعمل بسرعة قبل أن يصلب الحوس.

استخدم مسبارا معدنيا لوضع الأجنة بحيث يواجه عمود زجاج الغطاء تحت المجهر الاستريو. راقب مواضع الأجنة وأعد ضبطها حسب الضرورة حتى تصلب الأجارو. عندما يتجمد الأجارو ، استخدم وسط جنين دانيوس واحد لملء الطبق السفلي الزجاجي.

للتحضير لتحويل الصورة ، اضبط الحاضنة على 28 درجة مئوية وضع قطرة كبيرة من زيت الغمر على الهدف للتأكد من أن طبقة الزيت بين الهدف وزجاج الغطاء لن تنكسر أثناء انتقال المرحلة إلى أوضاع جنين مختلفة. أثناء التصوير بشكل آمن ، ضع الطبق السفلي الزجاجي على المسرح حتى لا يتحول الطبق عندما تتحرك المرحلة. بعد ذلك في حزمة برامج المجهر متحد البؤر ، حدد موضع كل جنين.

اضبط عمق Z لكل جنين وحاول استهداف نفس المستوى تقريبا في كل جنين باستخدام كل من الليزر 4 88 و 5 43 نانومتر. الحصول على صور ما قبل تحويل الصور. ثم قم بتكوين برنامج المجهر متحد البؤر لتصوير كل موضع من المواضع المحددة مسبقا بظروف التصوير المناسبة.

كل 10 أو 20 دقيقة أو خمس ساعات من الدورة التدريبية للتصوير ، قم بتحويل مفتاح البروتين الاندماجي إلى هدف 10 × وتعريض مجموعات الأجنة لضوء الأشعة فوق البنفسجية من مصباح الزئبق مع مرشح حوالي 300 إلى 400 نانومتر عند إخراج 100٪ لمدة دقيقتين. قم بتحويل التركيز على طول المحور Z لتعزيز تحويل الصورة بشكل موحد بعد تحويل الصورة. قم بالتبديل مرة أخرى إلى الهدف 25 × أو 40 × على الفور وللتأكد من أن المواضع المحددة مسبقا لا تزال دقيقة.

إذا تحول الطبق أثناء تحويل الصورة ، فأعد تحديد مواضع الأجنة. ابدأ الدورة الزمنية للتصوير واتركها تعمل لمدة خمس ساعات. لاحظ الوقت المنقضي بين تحويل الصورة وبدء التصوير لكل جنين.

تحقق من التجربة من حين لآخر وراقب مستوى وسيط دانييل ، وأضف المزيد إذا لزم الأمر. ابدأ بفحص مجموعات بيانات الدورة الزمنية بصريا من كل جنين. تجاهل مجموعات البيانات من الأجنة التي ماتت أثناء التصوير والتي تغيرت بشكل كبير ، أو التي تحتوي على مستويات منخفضة جدا من الإشارة المحولة بالصور ، أو التي تحتوي على مناطق من الخلايا تبدو غير عادية وتوقفت عن الحركة والانقسام.

باستخدام حزمة البرامج المستندة إلى Python ، يقوم PI F DAP بإنشاء قناع باستخدام إشارة Alexa 4 88 ، وهي داخل الخلايا بشكل صارم. لفصل الإشارة المحولة داخل الخلايا وخارجها ، قم بتطبيق القناع على صورة القناة الحمراء المقابلة لمنع النظر في وحدات البكسل داخل الخلايا. عند حساب متوسط شدة خارج الخلية لقياس متوسط الشدة داخل الخلايا ، اقلب القناع ، واعرض الصور المقنعة التي تم إنشاؤها ، وفحصها بصريا وتجاهل مجموعات البيانات التي لا تميز فيها الأقنعة بدقة بين الفضاء داخل الخلايا والفضاء خارج الخلية.

استخدم PI F DAP لحساب متوسط شدة التألق خارج الخلية وداخل الخلايا لكل صورة. ثم قم بتركيب بيانات التألق كما هو موضح هنا وفقا للإرشادات الواردة في بروتوكول النص ، واحسب البروتين خارج الخلية وداخل الخلية. نصف حياة تاو من معدل التخليص.

الحول كونستانس K هو بروتين مفرز يحفز التعبير عن جينات الأديم الباطن الخاطئة أثناء التطور الجنيني لسمك الزرد. في هذه التجربة ، تم حقن الأجنة بشكل مشترك مع Alexa 4 88 dextran و mRNA الذي يشفر الحول DENDRA Two وإخضاعها لمقايسة F DAP. كما هو موضح هنا ، تقل شدة الإشارة المحولة للصور خارج الخلية بمرور الوقت.

باستخدام PI F dap ، تم إنشاء ملامح شدة خارج الخلية من 23 جنينا وتم تزويد البيانات بنموذج إزالة من الدرجة الأولى. تشير النتائج إلى متوسط نصف عمر تاو يبلغ 116 دقيقة. ملامح كثافة مماثلة والبروتين.

تم الحصول على فترات نصف العمر عندما كانت الفترات الفاصلة بين التصوير 10 أو 20 دقيقة. يشير إلى أن تبييض الصور أو تحويل الصورة غير المقصود لم يساهم بشكل كبير في تغيرات الشدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تسوس التألق بعد تحويل الصورة.

للقياس في الجسم الحي. عمر النصف لبروتينات الاندماج القابلة للتحويل الضوئية في أجنة الزرد الحية.