TIRFM والحساسة للدرجة الحموضة GFP-تحقيقات في تقييم ناقل عصبي الحويصلة حيوية في خلايا SH-SY5Y العصبية: التصوير خلية وتحليل البيانات

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في ديناميكيات حويصلة الناقل العصبي في خلايا الورم الأرومي العصبي باستخدام مجسات حساسة لدرجة الحموضة والفحص المجهري الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي أو أرض العشب. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء الخلايا أولا على زلات الغطاء الزجاجي ونقلها باستخدام مجسات فلورية حساسة لدرجة الحموضة المشفرة وراثيا لاندماج الحويصلة وإعادة تدويرها ، والتي تستهدف بشكل انتقائي الحويصلات المتشابكة. من المتوقع أن يتم التعبير عن البروتين في غضون 24 إلى 48 ساعة.

الخطوة الثانية هي تسجيل ديناميكيات الحويصلة عن طريق الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي. هذه الخطوة مهمة بشكل خاص لنجاح التجربة ويتم توفير وصف خطوة بخطوة حول كيفية تحقيق تكوين العشب. مقبل. بمجرد الوصول إلى تكوين العشب الصحيح ، يمكن تسجيل الصور المتسلسلة تلقائيا بواسطة البرنامج في الظروف القاعدية أو الظروف المحفزة.

الخطوة الأخيرة هي معالجة الصور واستخراج البيانات من مقاطع الفيديو باستخدام برامج تجارية أو خوارزميات محلية الصنع. في النهاية ، استخدام المجهر العشب لتسجيل التغييرات في إشارة الفلورسنت المشتقة من اندماج الحويصلة إلى غشاء البلازما. من الممكن الحصول على معلومات حول تواتر أحداث الاندماج وطريقة اندماج الحويصلة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الفحص المجهري الكهربائي والفيزيولوجيا الكهربية ، هي أنها توفر حلا خاصا ومؤقتا مطلوبا للكشف عن ديناميكيات الحويصلة. في الواقع ، تسمح الصور شديدة التباين التي تم الحصول عليها بواسطة هذه التقنية باكتشاف الإشارات من الحويصلات المفردة. يوفر تحليل الحصول على الصور الأساسية الرخيصة الحل المؤقت الضروري لاكتشاف الديناميكيات.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال العلوم العصبية ، مثل فهم دور بروتين متشابك معين في ديناميكيات الدراجات ، أو آلية عمل الأدوية التي تعمل على الإرسال المتشابك. بشكل عام ، الأفراد الجدد في هذا الأمر ، نحن نكافح مع هذا التحليل لأن الإجراءات التلقائية تماما لمتابعة الحويصلة وتسجيل تذبذب إشارة PROEs ليست متاحة دائما. أولا ، فكرة هذه الطريقة عندما قررنا التحقيق في تأثير البروتين المتحور الممرض أو المشبكي على إطلاق حويصلة ناقل Nevo.

تكن الطرق الحالية شاملة بما فيه الكفاية ، لذلك قررنا إعداد هذه التقنية في خط خلايا الورم الأرومي العصبي SH SY five one للوصول إلى الحل المناسب. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية كخطوة رئيسية ، مثل كيفية تحقيق تكوين المستوى الرابع وكيفية استخراج البيانات الكمية من مقاطع الفيديو أمر بالغ الأهمية لشرح استخدام الكلمة بينما يمكن أن تكون أكثر قابلية للفهم والإقناع. إذا تم تصورها.

لإجراء تصوير العشب ، قم بإعداد مجهر مقلوب آلي ومصدر ليزر وشريط تمرير العشب كما هو موضح في بروتوكول النص. لتحقيق إضاءة العشب. قم بإزالة الغطاء الزجاجي بالخلايا المنقولة وأدخله في غرفة التصوير المناسبة.

قم بتجميع الغرفة وأضف 500 ميكرولتر من محلول جرس كريبس في وسط الزجاج. ثم أضف الزيت فوق الهدف. ضع غرفة التصوير على مسرح المجهر وضع الهدف أسفل زلة الغطاء الزجاجي.

ضع الغطاء الآمن فوق العينة في وضع مضان epi. ركز على زلة الغطاء واختر الخلايا المنقولة الموضوعة في مركز الغرفة تحت تحكم البرنامج. قم بالتبديل إلى إضاءة العشب في الوضع المباشر.

لضبط تكوين العشب ، تحقق من موضع الشعاع الذي يخرج من الهدف على غطاء العينة. عندما يتم وضع الشعاع في وسط العدسة الشيئية ، تظهر بقعة في وسط غطاء عينة العشب ويتم تصوير الخلية في وضع تألق epi. للوصول إلى الزاوية الحرجة ، حرك البقعة المركزة في الاتجاه Y باستخدام برغي ضبط الزاوية الموجود على شريط تمرير العشب.

عندما يتقارب الشعاع على مستوى العينة بزاوية أكبر من الزاوية الحرجة ، تختفي البقعة ويظهر خط مركزي رفيع مستقيم في منتصف غطاء العينة. لضبط زاوية العشب ، استخدم عينة خلية. شاهد صورة التألق على الفيديو.

في هذه المرحلة ، لا تزال الصورة الشبيهة بالفلورة مرئية. حرك المسمار برفق حتى يتم تحقيق حالة العشب. هنا يتم التركيز على مستوى بصري واحد فقط من الخلية ، مما ينتج عنه صورة مسطحة ذات تباين عالي.

لإجراء تصوير العينة، اضبط تجربة اللقطات المتتابعة أحادية القناة بين أوقات التعريض الضوئي المناسبة بين 40 و80 مللي ثانية. الحصول على صور بتردد أخذ عينات واحد أو اثنين من الهرتز. أضف 500 ميكرولتر من محلول كريبس جرس وسجل الخلايا في وضع الفحص المجهري للعشب.

وفر الوقت الصور المتسلسلة لحالة الراحة. ركز على نفس الخلية وسجل في نفس ظروف الراحة. بعد خمسة إطارات ، أضف خمسة ميكرولترات من محلول كلوريد البوتاسيوم كريبس رنجر واحتفظ بكلوريد البوتاسيوم في الغرفة.

وفر الوقت. صور متسلسلة للحالة المحفزة. استخدم ماكرو شدة التألق التسلسلي لشدة التألق أو القياس الكمي في منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار للصورة على مدار الفيلم.

للقيام بذلك ، أولا ، افتح الصور المتسلسلة للوقت. انتقل إلى قائمة الماكرو وحدد شدة التتابع الفلوري. في نافذة التحليل، تنقل.

لتحديد عائد الاستثمار، اختر إحدى أدوات التحديد في القائمة. لإنشاء عائد الاستثمار ، ضع ثلاثة عائد استثمار في مناطق من غشاء الخلية بدون بقع. بالنسبة لتناضح العكسي في الخلفية ، أستخدم عائد الاستثمار في الخلفية لتقييم تبييض الصور وتعيين عتبة تحليل حدث الاندماج.

مع تحديد عائد الاستثمار، انقر فوق موافق. احسب تلقائيا متوسط شدة التألق لكل عائد استثمار على مدار الفيلم ، وقم بتصدير البيانات إلى برنامج جداول بيانات لمزيد من التحليل. لتقييم التبييض الصورة ، افتح شدة التألق ارتفع.

عائد الاستثمار في الخلفية على تطبيع قيم شدة التألق في كل رتل إلى قيمة الشدة الأولية ومتوسط القيم. قم بتمييز متوسط البيانات وإنشاء مخطط خطي باستخدام خيارات قائمة الرسم البياني. من قائمة تحليل البيانات، حدد خط الاتجاه لفتح مربع حوار تحليل المخطط.

قم بتعيين نوع الانحدار إلى الانحدار الأسي. ثم حدد عرض المعادلة على الرسم البياني. في نافذة الرسم البياني ، تظهر المعادلة الأسية ويتم تعيين قيم المعلمات تلقائيا.

بعد تطبيق التصحيح الأسي على قيم الشدة كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتعيين العتبة عن طريق فتح خلفية طبيعية ومصححة. ثم يحسب عائد الاستثمار متوسط إشارة الفلورسنت وانحرافها المعياري. يمثل متوسط القيمة زائد ثلاث وحدات انحراف معياري العتبة.

لتحديد أحداث الاندماج. أولا ، افتح الصور المتسلسلة الزمنية باستخدام برنامج تحليل الصور ، وقم بتطبيق مرشح Gaussian على تسلسل الصورة النشط. قم بتحليل الصور باستخدام كائنات عد الأداة أو ماكرو، والذي يسمح بتحديد كائن يحتوي وحدات البكسل الخاصة به على متوسط شدة مضان ضمن نطاق محدد.

قم بتعيين نطاق الكثافة يدويا باستخدام وظيفة العتبة ، وقم بتطبيق كائنات تصفية ماكرو لتحديد الكائنات التي تلبي معايير محددة فقط. أولا تطبيق خيار النطاقات للجانب. يشير العرض إلى الارتفاع عن النسبة بين المحور الرئيسي والمحور الثانوي للقطع الناقص المكافئ للكائن.

القيم الكافية للجانب هي حد أدنى واحد وحد أقصى 2.3. ثم قم بتطبيق نطاقات لمعيار القطر في تقارير قطر البكسل عن متوسط طول الأقطار المقاسة على فترات درجتين ، والانضمام إلى نقطتين محددتين والمرور عبر OID للكائن. بعد ذلك حدد كائنات العرض.

ستظهر الكائنات المحددة متراكبة على دليل صورة الفحص المجهري للعشب في التحليل فقط تلك البقع التي تظهر زيادة عابرة قصيرة في شدة التألق متبوعة مباشرة بفقدان ملحوظ للإشارة. استخدم التحديد الدائري يدويا لإنشاء عائد استثمار بقطر بقعة واحد تقريبا شعاعيا حول الحويصلة المحددة. مع تحديد عائد الاستثمار، احسب متوسط شدة التألق لكل عائد استثمار على مدار الفيلم.

قم بتصدير المسار الزمني للتغيرات الفلورية المقاسة في كل عائد استثمار تجريبي إلى جدول بيانات تابع لتطبيع قيمة الشدة في كل إطار إلى شدة التألق الأولية. بعد تطبيق التصحيح الأسي على قيم الشدة في كل إطار ، كما كان من قبل ، قم بتطبيق الوظائف المنطقية باستخدام جداول البيانات أو حزم الرياضيات لحساب العدد الإجمالي لأحداث الاندماج ، ووقت حدوث كل اندماج وسعة ذروة الفلورسنت. افترض أن زيادة شدة التألق تتجاوز العتبة كاندماج حويصلية في غشاء البلازما والذروة الناتجة كحدث اندماج.

احسب عرض الذروة كفرق بين قيمة X الأخيرة والأولى لكل ذروة. ثم اضرب هذه القيمة في واحد على تردد أخذ العينات. ضع في اعتبارك هذه القيمة وقت اندماج الحويصلة والالتصاق في غشاء البلازما قبل الحويصلة وإعادة التحمض وإعادة التدوير.

بعد ذلك ، احسب مساحة الخلية بأكملها أسفل المنحنى كمجموع للقيم فوق العتبة. ضع في اعتبارك هذه القيمة على أنها تغير فلوري صافي خلال وقت التسجيل بسبب النشاط المشبكي التلقائي أو المستحث ، احسب ارتفاع الذروة على أنه الفرق بين الحد الأقصى لقيمة y لكل ذروة والعتبة ، واعتبر هذه القيمة مؤشرا على نوع الاندماج. في تحليل الخلية بأكملها ، يتم تحليل العدد الإجمالي وتواتر أحداث الاندماج التي تحدث في الخلية في ظل ظروف الراحة.

تقترب الحويصلات أحيانا من غشاء البلازما وتندمج معه في مخطط شدة الفلورسنت. وينعكس ذلك من خلال التغيير المفاجئ في شدة الفلورسنت على العتبة بعد تطبيق حافز السكرتير. تظهر قمم مختلفة من شدة التألق المتغيرة فجأة في مخطط ملف تعريف شدة التألق.

لاحظ الزيادة في ذروة العدد والطول بعد تحفيز البوتاسيوم. في تحليل الذروة الفردية ، يتم تحليل كل حدث اندماج فردي. يتم قياس معلمتين.

عرض الذروة ، الذي يتوافق مع وقت الحويصلة والالتصاق والاندماج في غشاء البلازما ، وكذلك ارتفاع الذروة ، مما يعكس آلية ذروة الاندماج. في ظل إزالة الاستقطاب من البوتاسيوم ، يزداد ارتفاع الذروة وعرضها ، مما يعكس تغييرا في اندماج الحويصلة الحركية في غشاء البلازما. أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تقنية العلبة هذه يمكن أن تسمح فقط بتصور الحدث الذي يحدث في غشاء البلازما أو بعد هذا الإجراء مباشرة.

إجراء طريقة أخرى ، مثل الفحص المجهري الثري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل مصير الدراجات الداخلية والبروتينات داخل الخلايا بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين العاملين في مجال البيولوجيا الخلوية وعلم وظائف الأعضاء لدراسة الأحداث الديناميكية التي تحدث في الغشاء الشخصي ، مثل إفراز الخلايا المثانية ، وإصدار مصفوفة الخلية ، والتدفقات الأيونية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحقيق تكوين المستوى الرابع ، وتسجيل الديناميكيات الرأسية ، وتحليل البيانات.