في وقت واحد تسجيل الكهربية والصغرى، والحقن وكلاء المثبطة في الدماغ القوارض

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مسار حقن منخفض التكلفة للحقن المجهري للنواقل العصبية في الأكيمة العلوية للفأر مع مراقبة النشاط العصبي متعدد الوحدات. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق صنع ماصة زجاجية باستخدام أنبوبة شعرية زجاجية وجهاز سحب الماصات المجهرية الرأسي. وتتمثل الخطوة الثانية في إدخال سلك فضي في الأنبوبة الشعرية مع ترك جزء من السلك بارزاً من الطرف غير المستدق.

بعد ذلك، يُستخدم الغراء لإنشاء سدادة محكمة بين الماصة الزجاجية وإبرة تحت الجلد. وتتمثل الخطوات النهائية في ملء الماصة بمحلول GABA الملون بلون "سماء شيكاغو الزرقاء"، وتوصيلها بمحقنة دقيقة مملوءة بالزيت المعدني ومثبتة في حاقن دقيق. وفي النهاية، يمكن استخدام هذا التصميم للجهاز الذي يتكون من أجزاء متاحة وبأسعار معقولة لتعطيل تراكيب الدماغ العميقة أثناء تسجيل النشاط العصبي للمنطقة المعطلة قبل وأثناء وبعد حقن الدواء.

توجد عدة مزايا لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية الأخرى، مثل نبضات الضغط القائمة على الغاز وأنظمة الحقن الضوئي. إحداها هي أنها طريقة فعالة من حيث التكلفة تسمح بالتحكم القائم على الوظيفة في إيصال الدواء، مما يحد من تلف الأنسجة الناتج عن الحقن المفرط. وميزة أخرى يوفرها هذا النظام هي إمكانية التسجيل المدمجة، والتي تتيح تحكماً فعالاً في المكون الزمني لتعطيل النشاط العصبي.

لتحضير ماصات الحقن الخاصة بالتسجيل، ابدأ بسحب أنبوب شعري بطول 7 cm وقطر خارجي يبلغ 1 mm باستخدام جهاز سحب الشعيرات طراز cop vertical Seven 20 أو وحدة مماثلة. اضبط السخان على 18 والصمام الملفي (solenoid) على 1، بعد ذلك، وبستخدام القفازات، قم بكسر الطرف يدويًا لعمل فتحة، ثم تحقق تحت المجهر من أن القطر الداخلي يتراوح بين 30 و 40 µm.

قس هذا باستخدام مسطرة محدد المنظر. سينتج عن ذلك معاوقة منخفضة نسبياً تتراوح بين 0.3 إلى 0.6 mega ohms. بعد ذلك، ومن الطرف غير المستدق، أدخل سلكاً فضياً في الماصة بطول سبعة سنتيمترات تقريباً، واترك مسافة من واحد إلى اثنين سنتيمتر تتدلى خارج الماصة.

قم بثني هذا السلك الزائد بشكل متعامد مع الشعيرية. بعد ذلك، أحضر إبرة تحت الجلد بقياس 30 gauge وقم بوضع لاصق بلاستيكي مرن على ساق الإبرة. ثم أدخل الإبرة ببطء في الماصة.

قدر الإمكان. أضف المزيد من المادة اللاصقة لإنشاء سدّ عند نقطة الالتقاء بين الماصة والإبرة. مع توجيه طرف الماصة للأعلى، اترك المجموعة لتجف لمدة 12 ساعة تقريباً.

بعد تخدير الجرذ ووضعه في إطار التوجيه المجسم (stereotaxic frame)، ضع مرهم العيون وقم بحلاقة الرأس جيداً. وبعد وضع المخدر الموضعي والتأكد من وصول الحيوان إلى مستوى التخدير الجراحي، ابدأ بشق فروة الرأس على طول الخط الناصفي باستخدام شفرة مشرط رقم 10، مما يؤدي إلى كشف الغرز الإكليلية والسهمية.

بعد ذلك، باستخدام ملعقة جراحية، حدد المراجع التشريحية Lambda و bgma. اضبط وضعية الرأس بحيث تكون هذه العلامات على مستوى واحد في نفس المستوى الأفقي. ثم قم بتصفير مؤشر صلب ودقيق، مثل أنبوب زجاجي، على bgma.

بعد ذلك، قم بضبط موضع الأنبوب إلى الموقع المطلوب باستخدام إحداثيات bgma. استخدم قلم تحديد لرسم مربع حول المنطقة المستهدفة لإجراء عملية ثقب الجمجمة. الآن وباستخدام المثقاب الجراحي المعقم، قم بإزالة العظم ببطء على طول العلامات.

ابدأ باستخدام أقل قدر ممكن من الضغط مع تحريك المثقاب باستمرار لتجنب تلف الأنسجة الناتج عن احتكاك رأس المثقاب عندما تصبح العظمة رقيقة، ثم قم بإزالة الجزء المربع بعناية باستخدام الملاقط. لا داعي لإزالة غشاء الـ Dora MA لأن المادة المحقونة ستخترقه لاحقاً. حافظ على ري القشرة المكشوفة باستخدام السائل الدماغي الشوكي.

قم بتجهيز المادة المراد حقنها عن طريق ملء سرنجة سعة 5 إلى 10 µL بزيت معدني أولاً. بعد ذلك، قم بتحضير العقار المطلوب مع صبغة في محلول ملحي فسيولوجي. هنا يتم خلط 0.5% من صبغة Chicago sky blue مع 300 µM من gaba.

قم الآن بملء ماصة الحقن عن طريق تعبئة حقنة سعة 1 mL أولاً بالمحلول المُحضّر، ثم استخدم الحقنة لتعبئة الماصة. عند إزالة الحقنة، حافظ على ضغط خفيف على المكبس، حتى لا يؤدي الفراغ إلى سحب المحلول من مسار الحقن. تحقق من عدم وجود أي تسرب للسوائل عند نقاط التسرب المحتملة.

استخدم مسحة لامتصاص أي سائل زائد وأعد التحقق من عدم وجود تسرب. الآن، قم بتوصيل الحقنة الدقيقة التي تحتوي على الزيت المعدني بمسار الحقن. ثم امسح أي محلول زائد.

باستخدام قطعة شاش، افحص طرف الحقن. يجب أن تكون قطرات صغيرة من المحلول قادرة على التدفق من خلاله، وإلا فإنه يكون مسدوداً؛ وبخلاف ذلك، قم بتثبيت المحقن الآن بإحكام في نظام مضخة دقيقة.

بعد ذلك، حرك موضع مسار الحقن إلى الإحداثيات المستهدفة وقم بخفض القطب الكهربائي إلى الـ superior colliculus، والذي يمكن تحديده من خلال تسجيل الجهود المستثارة بصرياً. وأثناء خفض القطب الكهربائي، قم بتطبيق ضغط إيجابي بسيط عن طريق الحقن بمعدل منخفض لتجنب الانسداد. أوقف عملية الحقن عند الوصول إلى البنية المستهدفة.

بعد إدخال الحقنة، قم بتغطية القشرة المكشوفة بآجار دافئ لمنع الجفاف. بعد الوضع النهائي للقطب الكهربائي، انتظر لمدة 30 دقيقة للسماح باستقرار الأنسجة المحيطة بالقطب. ثم احقن من 400 إلى 800 nanoliters من المحلول بمعدل 40 nanoliters في الدقيقة حتى يتم تنشيط النشاط العصبي في السويقة العلوية، ويجب أن يظهر القطب الكهربائي انخفاضاً في الارتفاعات الحادة (spikes) أثناء حقن المحلول المثبط.

تم الحصول على الجهود المستثارة بصرياً في القولب العلوي. فبعد ومضة مدتها 300 millisecond للعين المقابلة عند حقن gaba، تم تثبيط نشاط النبضات استجابةً لمحفز الومضة لمدة تتراوح من 45 إلى 60 دقيقة. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التحقق من عدم وجود تسريبات أثناء التعبئة والتأكد من تدفق محلول الدواء بحرية عبر طرف الحقن.