إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

الهدف العام من التجربة التالية هو دمج القنوات الأيونية ذات الجهد المسور في حويصلات صفائحية أحادية العملاقة وتوصيف نشاطها بقياسات مشبك التصحيح. يتم تحقيق ذلك عن طريق التجفيف الجزئي أولا ، وهو محلول من حويصلات صغيرة تحتوي على القناة الأيونية KVAP لإنشاء طبقة بروتين دهني. بعد ذلك ، يتم ترطيب الطبقة الدهنية ، مما يؤدي إلى تكوين ونمو حويصلات ALR العملاقة بحجم الخلية أو gvs التي تحتوي على القناة.

ثم يتم نقل gvs إلى غرفة التسجيل الخاصة بنا ويتم استئصال قطعة من غشاء GUV باستخدام ماصة رقعة لقياس التيارات الأيونية. تظهر النتائج أن القنوات الأيونية في غشاء GUV تنشط استجابة للتغيرات في جهد الغشاء بناء على تحليل التسجيلات الحالية. يمكن أن تساعد الفيزياء الأحادية العملاقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الفيزياء الحيوية المتعلقة بتفاعلات البروتين الغشائي

على سبيل المثال ، تفاعل البروتينات عبر الغشاء مع الخصائص الفيزيائية للغشاء الدهني. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لوظيفة قناة الحديد ذات الجهد المسور KVAP ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على القنوات الحديدية الأخرى ، والناقلات ، والمضخات ، والبروتينات عبر الغشاء بشكل عام. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية مثل الخطوات التي تنطوي على التلاعب بالحويصلات العملاقة.

كيفية التقاط قراءة المقالات فقط بعد تحضير المحاليل والحويصلات الصغيرة المفردة التي تحتوي على KVAP. وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد غرفة التكوين الكهربائي عن طريق إدخال الأسلاك أولا من خلال الثقوب وتدوير الأسلاك ومسحها للتأكد من أنها نظيفة ومشمسة وتجف تحت تيار من النيتروجين أو الهواء. قم بإعداد 30 ميكرولترا من ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر من نظام تعليق سيارات الدفع الرباعي في المخزن المؤقت لسيارات الدفع الرباعي كما هو موضح في بروتوكول النص ، واخلط المحلول بقوة لإيداع محلول سيارات الدفع الرباعي.

استخدم ماصة سعة ميكرولتر أو حقنة زجاجية سعة خمسة ميكرولتر لوضع قطرات صغيرة من محلول سيارات الدفع الرباعي على الأسلاك. تأكد من أن القطرات صغيرة بما يكفي ومتباعدة بما يكفي بحيث لا تلمس أو تندمج دع سيارات الدفع الرباعي المودعة تجف لمدة 30 دقيقة في الهواء الطلق.

عندما تستقر القطرات ، قم بتدوير السلك بحيث يسهل مراقبة رواسب الدهون بالمجهر. بعد ذلك ، استخدم حقنة لتطبيق الشحم المفرغ على قاع الغرفة حول الآبار الثلاثة واضغط برفق على زلة غطاء 40 ملم × 22 ملم ضدها لإغلاق قاع الغرفة بحيث تلتصق بدون فجوة. ثم استخدم معجون السقف لإغلاق جوانب الغرفة وتطبيق الشحوم المفرغة على الجزء العلوي من الغرفة التي تحدد الآبار الثلاثة.

أضف المخزن المؤقت للنمو ببطء حتى تمتلئ كل بئر إلى الأعلى. تجنب أي حركة سريعة للمحلول في الآبار كما يمكن ذلك. قم بتجريد الطبقة الدهنية من الأقطاب الكهربائية.

أغلق الحجرة بالضغط برفق على الغطاء العلوي على الشحوم. الحرص على عدم إزاحة زلة الغطاء السفلي. استخدم مقطعي التمساح لتوصيل مولد الإشارة بالأسلاك.

اضبط التردد وفقا لتركيز الملح للمخزن المؤقت المستخدم وبمقياس متعدد وضبط الجهد عبر الأسلاك. أيضا وفقا للمخزن المؤقت الخاص بك ، استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية الغرفة لحماية النباتات الأربعة من الضوء. اترك الأشعة فوق المستمرة G لتنمو لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في المخزن المؤقت المنخفض للملح و 12 ساعة أو بين عشية وضحاها للمخزن المؤقت عالي الملح.

بعد الحضانة ، افصل الغرفة عن المولد وضعها بعناية على مجهر مقلوب. لتقييم بلازما نمو GUV ، قم بتنظيف شريحة الغطاء لمدة دقيقة واحدة حتى ينتشر محلول ARO بشكل جيد عليها. في غضون 15 دقيقة من تنظيف شريحة الغطاء ، ضع 200 ميكرولتر من محلول aro الدافئ المحضر وفقا لبروتوكول النص بحيث يبلل السطح بالكامل.

قم بإمالة الشريحة عموديا والمس الحافة السفلية على منديل لإزالة السوائل الزائدة ، مع ترك طبقة رقيقة وناعمة من العروف على الشريحة. ضع الشريحة على طبق ساخن أو فرن على حرارة 60 درجة مئوية واتركها حتى تجف لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، ضع زلة غطاء مطلية ب AROS في طبق بتري قياسي يبلغ طوله 3.5 سم.

ثم بعد تحضير محلول سيارات الدفع الرباعي ، ضع برفق حوالي 15 ميكرولترا في حوالي 30 قطرة صغيرة جدا على سطح الأروس. احرص على عدم تشويه طبقة aros كثيرا. ضع الشريحة تحت تيار لطيف من النيتروجين لمدة 10 إلى 15 دقيقة واتبع تبخر المخزن المؤقت بالعين.

عندما تجف القطرات بمجرد جفاف سيارات الدفع الرباعي ، أضف حوالي ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للنمو لتغطية سطح الشريحة. اسمح للتورم بالاستمرار لمدة 30 دقيقة تقريبا ، ثم استخدم مجهرا مقلوبا مع تباين الطور أو DIC لفحص نمو UUVs GU في غرفة النمو لتصحيح المشبك gu UUVs أكلت الغرفة عن طريق إضافة خمسة ملليغرام لكل مليلتر من محلول بيتا كين ، مما يمنع Gus من الالتصاق ، الانتشار والتمزق. احتضن لمدة خمس دقائق ثم اشطفه ، وأدخل القطب الأرضي واستخدم عازلة المراقبة لملء الغرفة.

بعد ذلك ، انقل الأشعة فوق المستمرة G UUVs إلى غرفة المراقبة للطائرات UUV GU المكونة بالكهرباء. افتح حجرة النمو عن طريق إزالة زلة الغطاء العلوي برفق. ضع طرف الماصة مباشرة فوق كل سلك ولفصل UUVs من GU ، استنشق ببطء حوالي 10 ميكرولتر أثناء تحريك طرف الماصة على طول السلك للحصول على UUVs GU التورم بمساعدة الهلام.

اضغط أولا على جانب طبق Petri عدة مرات لفصل UUVs GU عن سطح انزلاق الغطاء. ضع طرف الماصة فوق زلة الغطاء مباشرة واسحب 10 ميكرولتر أثناء سحب الطرف للخلف فوق السطح ، وانقل GVS المحصودة مباشرة إلى غرفة المراقبة. انتظر بضع دقائق حتى يستقر Gus في الأسفل لتصحيح مشبك GVS.

استخدم المخزن المؤقت للمراقبة لملء ماصة رقعة جديدة وتركيبها على مرحلة رأس مشبك التصحيح. ابحث في الغرفة لتحديد موقع GUV خال من العيوب وتحقق من احتوائه على بروتين الفلورسنت. استخدم ضغطا موجبا ثابتا لأكثر من 100 باسكال للحفاظ على نظافة ماصة الرقعة من الداخل وأدخل ماصة التصحيح في الغرفة.

أحضر الماصة اللاصقة إلى مجال الرؤية وقم بتطبيق نبضات الاختبار لقياس أو تعويض إزاحة جهد الماصة ومقاومتها. ثم افحص الماصة تحت إضاءة الفلورسنت للتأكد من نظافة الطرف. أحضر الماصة اللاصقة باتجاه GUV وإذا لزم الأمر قم بتقليل الضغط الإيجابي في نفس الوقت حتى لا يؤدي التدفق الخارجي من ماصة التصحيح إلى هروب GUV.

عندما تكون ماصة التصحيح قريبة من GUV، قم بالضغط السلبي لسحب GUV مقابل ماصة التصحيح. راقب المقاومة عندما يدخل لسان غشاء GUV إلى ماصة التصحيح ويتشكل مانع تسرب الجيجا. عندما يتم استئصال رقعة الغشاء من الداخل إلى الخارج من GUV ويكون ختم الجيجا مستقرا ، قم بإيقاف تشغيل نبضات الاختبار وقم بتطبيق بروتوكول الجهد كما هو موضح في النص.

يوضح هذا الشكل صور DIC و epi الفلورية لGUV خالية من العيوب. يؤكد مضان البروتين المنتظم في غشاء GUV أن KVAP مدمج في GUV بدلا من البقاء في الفيلم الدهني ولم يتشكل المجاميع التي أنتجها Gus باستخدام الطرق الثلاث تظهر هنا. تم تحجيم إشارات الدهون والبروتين الفلورية إلى نفس متوسط الكثافة بحيث يكون للأشعة فوق البنفسجية ذات الكثافة البروتينية المنخفضة أو العالية ظل أرجواني أو أخضر في صور التراكب بينما تكون GVS ذات كثافة البروتين المتوسطة بيضاء.

تم تحديد الأشعة فوق المسترجحة G المعزولة الخالية من العيوب ويظهر توزيع حجم GUV هنا. عادة ما ينتج عن التكوين الكهربائي UUVs G الخالية من العيوب أكثر من التورم بمساعدة الهلام ، لكن GUS الناتج عن التكوين الكهربائي يكون أصغر. يظهر هنا توزيع كثافة البروتين المستنبط من مضان GUV.

التكوين الكهربائي مع عازلة عالية الملح UUVs GU بكثافة بروتين متفاوتة. تختلف الكثافة أقل بكثير بالنسبة للتكوين الكهربائي مع مخزن مؤقت منخفض للملح وكثافة البروتين في UUVs GU التي تنتجها التورم بمساعدة الهلام موحدة بشكل ملحوظ اعتمادا على تركيز البروتين في الرقعة المستأثورة. تظهر الآثار الحالية إما قنوات مفردة أو مجموعة من القنوات.

يظهر KVAP الفتح المعتمد على الجهد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحويصلات العملاقة للأجسام الهشة التي لا تقاوم الإجهاد الهائل والتناضحي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق مثل سحب أنابيب النانو الدهنية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل استشعار انحناء البروتينات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج GVS تحتوي على بروتينات معاد تكوينها وظيفيا.