طريقة بسيطة لDNA الإسفار في الموقع التهجين لسحق الكروموسومات
يناير 6, 2015
هنا ، نقدم طريقة بسيطة لإجراء التهجين الموضعي للحمض النووي الفلوري (DNA ISH) لتصور التسلسلات غير المتجانسة المتكررة على الكروموسومات المثبتة على الشريحة. تتطلب الطريقة الحد الأدنى من الكواشف وهي متعددة الاستخدامات للاستخدام مع المجسات القصيرة أو الطويلة ، والأنسجة المختلفة ، والكشف عن الإشارات الفلورية أو غير الفلورية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تهجين الحمض النووي في الموقع لتعيين التسلسلات اللونية غير المتجانسة إلى الكروموسومات الانقسامية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح أدمغة الثلث في يرقات ذبابة الفاكهة النجمية ، أو أي نسيج آخر ذي أهمية. الخطوة الثانية هي إصلاح الأنسجة على زلة الغطاء.
بعد ذلك ، يتم سحق الأنسجة بين زلة الغطاء والانزلاق. لتحضير الكروموسومات للتهجين ، فإن الخطوة الأخيرة هي تهجين مجسات oligo القصيرة المركبة إلى الأنسجة المسحوقة. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري لإظهار توطين التسلسلات المكملة لمسبارات oligo على الكروموسومات.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على الأساليب الحالية هي بساطتها. تتضمن معظم طرق التهجين الأخرى للكروموسومات و C غسلات بكميات كبيرة من أميد الشكل ، والتي يمكن أن تكون باهظة الثمن وفوضوية. لا تتطلب طريقتنا أي شكل من أشكال غسيل IDE ، مما يجعلها تقنية أرخص وأنظف وأسرع.
على الرغم من أن هذه الطريقة توفر طريقة بسيطة لرسم خريطة واضحة للتسلسلات على الكروموسومات الجسدية لأدمغة ذبابة الفاكهة ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لتعيين تسلسلات على أنواع أخرى من الكروموسومات من أنسجة مختلفة في الكائنات الحية المختلفة. لكل شريحة يتم إجراؤها ، قم بإعداد أربعة أو خمسة مناديل ، ولكن ليس أكثر لتشريح الدماغ. ابدأ باختيار يرقات الطور الثالث المتجولة وجمعها في قطرة XPBS واحدة.
اختر قوارير لجمعها ليست مكتظة. تحت نطاق التشريح ، استخدم ملاقط فائقة الدقة للإمساك بخطافات الفم وزوج آخر للاستيلاء على ثلثي طول الجسم. ثم اسحب خطافات الفم برفق لفضح الدماغ والعقد البطنية والغدد اللعابية وأجزاء من الجهاز الهضمي.
بعد ذلك ، قم بتحريك الدماغ والعقد البطنية بعيدا عن الأنسجة الأخرى ونقلها إلى قطرة من XPBT واحد على طبق بلاستيكي. بالنسبة لتشريح الخصية ، اجمع الذكور البالغ من العمر ثلاثة أيام. بوي البالغ من العمر ثلاثة أيام لها أجساد صفراء وعيون حمراء.
أولئك الذين لديهم وسادات أجنحة أصغر هم من الذكور. أمسك الخادرة في الجزء العلوي من البطن بالقرب من منطقة الصدر بزوج واحد من الملقط وزوج ثان من الملقط. أمسك الطرف البعيد جدا من البطن ، ثم اسحب الخصيتين على شكل دمعة.
إنها محاطة بأجسام دهنية يمكن التخلص منها برفق ، وفصل أي أجزاء خارجية من الجسم عن الخصيتين ، مما يمنع التكسير المناسب وينقل الخصيتين إلى قطرة XPBT واحدة على طبق نظيف. بمجرد جمع جميع الأنسجة ، قم بمعالجتها بمحلول منخفض التوتر لتحسين فصل الكروماتيدات الشقيقة. في المناطق اللونية e ، انقل الأنسجة إلى قطرة 0.5٪ سترات الصوديوم لمدة 10 دقائق.
للحصول على هذا التأثير ، لا ينصح بالكولشيسين لأنه يمكن أن يسبب القطع الأثرية في مورفولوجيا الكروموسوم. الآن ، قم بإصلاح الأنسجة باستخدام ملاقط فائقة الدقة. انقلها إلى قطرة 20 ميكرولتر من 2.5٪ PFA الطازج في 45٪ من حمض الأسيتيك على طبقة نظيفة من سيجما ، وغطاء انزلاق ، ومساحة الأنسجة بالتساوي في المثبت ، واحتضانها لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم استمر في سحق زلات الغطاء ، ابدأ بوضع شريحة مطلية بالبولي ليسين برفق ووجهها لأسفل على الأنسجة وانزلاق الغطاء.
اسمح للغطاء بالانزلاق بالالتصاق بالجانب السفلي من الشريحة دون الضغط. علاج. يساعد الغطاء المغطى بطبقة سيجما على ضمان بقاء أنسجة القرع على الشريحة بعد إزالة زلة الغطاء. ومع ذلك ، نادرا ما يظل النسيج ملتصقا بزلة الغطاء.
خلال هذه الخطوة ، نوصي بإجراء قرع الأنسجة المكررة. الآن اقلب الشريحة وضعها في قطعة مطوية من الورق السميك. ثم على سطح ثابت ، باستخدام الضغط على الإبهام بقوة شديدة لأسفل فوق زلة الغطاء.
لا تضغط بطريقة تنزلق الغطاء وإلا ستلطخ الأنسجة. عادة ما يؤدي الضغط القوي جدا إلى حدوث كروموسومات محلوبة بشكل جيد داخل أنسجة الاسكواش. ومع ذلك ، في بعض الأحيان ، قد تواجه تباينا في جودة الكروموسومات مثل الكروموسومات غير المكتملة أو المسحوقة أو المجزأة.
لذا مرة أخرى ، نوصي بإجراء اثنين أو ثلاثة من عمليات القرع المتكررة للأنسجة. انقل المجموعة إلى كتلة من الثلج لبضع دقائق ، ثم اغمرها في النيتروجين السائل حتى يتوقف النيتروجين عن الغليان أو لفترة أطول بعد إزالة الشريحة مباشرة قبل ذوبان الأنسجة، استخدم شفرة حلاقة جديدة لنفض الغبار عن زاوية من زلة الغطاء. وبالتالي إزالته.
احرص على تجنب خدش الأنسجة. ثم ضع الشريحة بسرعة في وعاء كوبلن مملوء بالإيثانول بنسبة 100٪ ، ودعنا نقع لمدة خمس دقائق على الأقل. قم بإزالة فتيل الشريحة بعيدا عن الإيثانول الزائد دون لمس الأنسجة واترك الشريحة تجف في الهواء لمدة ساعة.
يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح لأسابيع إلى شهور في غرفة التجفيف. ابدأ بإضافة 100 نانوجرام من كل مسبار إلى 20 ميكرولتر من مخزن مؤقت تهجين 1.1 × لمحلول 22 ميكرولتر من مخزن مؤقت تهجين واحد ×. ثم قم بتقطيع الخليط على الأنسجة الثابتة ، مع ترك الأنسجة كما هي وقم بتطبيق زلة غطاء برفق.
لن تمثل فقاعة الهواء الصغيرة التي لا تلامس الأنسجة مشاكل ، ولكن أي فقاعات أخرى ، تستدعي إعادة تطبيق زلة الغطاء. ضع الشريحة على الجانب المسطح من كتلة حرارية 95 درجة مئوية وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم. انتظر خمس دقائق يمكنك خلالها تحضير غرفة الرطوبة عن طريق إضافة مناشف ورقية مبللة إلى صندوق الأطراف.
ثم قم بإزالة الشريحة. لف الشريحة بعناية في شكل ممتد وانقلها إلى غرفة رطبة مكونة من منشفة مبللة في صندوق طرف ، احتضن الشريحة في الغرفة لمدة أربع ساعات إلى بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية. تعمل درجة الحرارة هذه بشكل جيد مع مجسات محتوى GC المنخفض ، ولكن بالنسبة للمجسات ذات المحتوى GC الأعلى ، قد تكون هناك حاجة إلى بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها في درجات حرارة التهجين.
بعد الحضانة ، قم بإزالة الفيلم بعناية وارفع زلة الغطاء ببطء بزاوية واحدة. ثم اغسل الشريحة ثلاث مرات في المخزن المؤقت 0.1 XSSC لمدة 15 دقيقة لكل غسلة. قم بتغطية البرطمان بورق الألمنيوم أثناء الغسيل لتقليل التعرض للضوء.
بالنسبة للمجسات الطويلة الحيوية ، أضف قضيب دومين أفادون واغسله قبل المتابعة. أولا ، جفف المنطقة المحيطة بالأنسجة وقم بتغطية الأنسجة ب 100 ميكرولتر من محلول الانسداد. ثم ضع برفق زلة غطاء جديدة دون محاصرة الفقاعات.
مرة أخرى ، لف الشريحة مع param. ثم احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثانيا ، بعد الحضانة ، قم بإزالة زلة الغطاء وصمة عار حول الأنسجة بمسح.
ثم على الأنسجة ، ضع 100 ميكرولتر من واحد إلى 1000 أكشة مخففة في SBT. تابع عن طريق تغطية الشريحة ولفها واحتضانها كما هو الحال مع الكتلة. أخيرا ، قم بإزالة زلة الغطاء بعناية وغسل الشريحة.
استخدم ثلاث غسلات في أربعة × SSCs T ، متبوعة بثلاث غسلات في 0.1 XSSC. يجب أن تكون مدة كل خطوة غسيل خمس دقائق على الأقل. بمتابعة البروتوكول ، جفف الشرائح عن طريق مسح المخزن المؤقت الزائد دون لمس الأنسجة.
ثم ضع جانب المنديل المنزلق لأعلى في مكان مظلم لمدة 10 إلى 15 دقيقة أو حتى تتبدد الرطوبة تماما. الآن ، قم بتركيب الشريحة باستخدام 11 ميكرولترا من درع المتجه مع DPI وخفضها بعناية على زلة غطاء معطف غير سيجما. إذا لم يصل الوسيط إلى جميع الحواف ، فقم بتطبيق بضعة ميكرولترات أخرى من الوسائط من الحافة وامسح أي فائض.
ثم أغلق زلة الغطاء بطلاء الأظافر وقم بتخزين الشريحة في وضع مستقيم في مكان مظلم بينما يجف طلاء الأظافر ، والذي يستغرق عادة نصف ساعة على الأقل. ثم قم بتخزين الشريحة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع وقم بتصوير الأنسجة في أسرع وقت ممكن. تم تهجين مجموعة من oligos الصغيرة المركبة تجاريا مع اقترانات الفلورسنت ومسبار بيوتينيل أطول من صنع Nick Translation إلى كروموسومات من عدة أنواع مختلفة من الأنسجة.
باستخدام المنهجية الموصوفة ، تعرف المسبار على ذبابة الفاكهة Melanogaster 359 تكرار القمر الصناعي على كتلة زوج كبيرة متعددة القواعد الضخمة على x ومنطقة أصغر بكثير على الكروموسوم الثالث. اكتشف مسبار أطول مقابل الساتل المستجيب فدرات تكرار تتكون من أرقام نسخ متكررة منخفضة نسبيا تبلغ حوالي 700. وبالتالي ، تسمح هذه الطريقة بتصور كتل الأقمار الصناعية الصغيرة جدا.
عندما تضاعفت مدة خطوة العلاج بالمحلول المنخفض التوتر إلى 10 دقائق ، زاد فصل الكروماتيدات الشقيقة شرقا. يمكن أن يقترن هذا الإجراء بطرق أخرى مثل تلطيخ الأجسام المضادة من أجل الإجابة على أسئلة مثل القيام ببروتينات كروماتين معينة مترجمة إلى تسلسلات محددة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تعرض هذه المقالة طريقة لتهجين الحمض النووي المتوهج في الموقع (DNA ISH) لتصور التسلسلات المتكررة غير المتجانسة على الكروموسومات. التقنية قابلة للتكيف مع أنواع مختلفة من الأنسجة وطوال المسبار، وتستخدم المجهر الفلوري للكشف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تهجين الحمض النووي في الموقع هو تقنية قوية لدراسة الهياكل الكروموسومية.
- الغير متجانسة تلعب دورًا حاسمًا في تنظيم الجينات والاستقرار الكروموسومي.
- المجهر الفلوري يسمح بتصور تسلسلات الحمض النووي المحددة.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنسجة مختلفة، مما يزيد من تنوعها.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة بسيطة لرسم خرائط للتسلسلات غير المتجانسة.
- لتصور هذه التسلسلات على الكروموسومات الانقسامية.
- لتوفير بروتوكول يتطلب مواد كيميائية قليلة.
الطرق المستخدمة
- تشريح أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة في المرحلة الثالثة أو أنسجة أخرى.
- تثبيت الأنسجة على شريحة زجاجية.
- سحق الأنسجة بين شريحة زجاجية وشريحة.
- تهجين مسابير أوليغو قصيرة مركبة إلى الكروموسومات المعدة.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح للتسلسلات غير المتجانسة على الكروموسومات.
- تبيان تنوع الطريقة مع أطوال مختلفة من المسابير.
- استخدام فعال للمجهر الفلوري للتوطين.
- متطلبات المواد الكيميائية الدنيا تزيد من إمكانية الوصول للباحثين.
الاستنتاجات
- الطريقة المطورة فعالة لدراسة الغير متجانسة.
- يمكن تكييفه مع ظروف تجريبية مختلفة.
- تساهم هذه التقنية في فهم الديناميكيات الكروموسومية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This streamlined DNA ISH method enables rapid, cost-effective mapping of repetitive DNA sequences to heterochromatic regions, addressing a key challenge in target validation where computational approaches fail. By eliminating formamide washes, the protocol reduces technical complexity and reagent burden, supporting early-stage mechanistic de-risking of chromosomal targets. The approach is particularly valuable for phenotypic screening workflows requiring reliable visualization of satellite repeats in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of repetitive DNA sequences in heterochromatic regions, supporting target validation in genomic regions inaccessible to computational methods.
- Operational Value: Eliminates formamide wash steps, reducing protocol time, cost, and technical variability for high-throughput target interrogation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for repetitive sequence localization, enabling assay standardization across insect tissue types.
- Operational Value: Uses simple laboratory supplies and short fluorescent oligo probes, facilitating assay scalability and reuse in screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system analysis by mapping sequences in Drosophila neural cells and Nasonia spermatocytes, providing mechanistic insight into chromosomal organization.
- Operational Value: Adaptable to larger probes and single-copy sequences, allowing translational extension to non-repetitive targets in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing of repetitive elements and enabling progression to lead identification through chromosomal target de-risking.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis interrogation of heterochromatic regions by providing direct visualization of repeat localization on mitotic chromosomes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support reliable compound or genetic perturbation screening in chromosomal contexts.
- Analytics: Generates measurable hybridization signals (e.g., multi-megabase pair blocks) that allow comparative analysis across conditions or genetic backgrounds.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation by visualizing targets in disease-relevant tissues such as neural cells and germline cells.
- Enterprise Reuse: Requires only basic lab equipment (dissection tools, cover slips, hybridization buffer, fluorescence microscope), positioning it as a reusable platform across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterochromatic regions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through elimination of variable formamide wash steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by lowering reagent costs and technical training barriers for target validation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets located in repetitive, heterochromatic genomic regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection (e.g., Drosophila larval brains, insect testes) and chromosome preparation techniques.
- Dependent on access to fluorescence microscopy and basic molecular biology reagents (fluorescent oligos, hybridization buffer, SSC buffers).
- Necessitates standardization of squashing pressure and incubation times to ensure consistent chromosome resolution across users.
- Adaptation to larger probes or single-copy sequences may require optimization of hybridization temperature and blocking steps.
- Practical limitations include potential variability in chromosome quality (incomplete or fragmented squashes), mitigated by performing replicate tissue squashes.
