طريقة بسيطة لDNA الإسفار

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام التهجين الموضعي للحمض النووي DNA لتعيين تسلسلات الكروماتين المغاير على الكروموسومات في الطور الانقسامي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة drosophila في الطور الثالث، أو أي نسيج آخر محل اهتمام. وتتمثل الخطوة الثانية في تثبيت النسيج على شريحة غطاء.

بعد ذلك، يتم سحق النسيج بين الشريحة الغطائية والشريحة الزجاجية. ولتحضير الكروموسومات لعملية التهجين، تتمثل الخطوة النهائية في تهجين مجسات oligo قصيرة ومصنعة مع النسيج المسحوق. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري لإظهار تموضع التسلسلات المكملة لمجسات oligo على الكروموسومات.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الحالية في بساطتها. تتضمن معظم طرق تهجين الكروموسومات وC two الأخرى عمليات غسيل بكميات كبيرة من الفورماميد، والتي قد تكون مكلفة وتسبب الفوضى. لا تتطلب طريقتنا أي عمليات غسيل بالفورماميد، مما يجعلها تقنية أقل تكلفة، وأكثر نظافة، وأسرع.

على الرغم من أن هذه الطريقة توفر وسيلة بسيطة لرسم خرائط التسلسلات بشكل مرئي على الكروموسومات الجسدية في أدمغة ذبابة الدروزوفيلا، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لرسم خرائط التسلسلات على أنواع أخرى من الكروموسومات في أنسجة مختلفة ومن كائنات حية متنوعة. بالنسبة لكل شريحة سيتم تحضيرها، قم بتجهيز أربعة أو خمسة أنسجة، ولكن لا تزد عن ذلك في حالات تشريح الدماغ. ابدأ باختيار يرقات الطور الثالث المتجولة وجمعها في قطرة من 1x PBS.

اختر الأنابيب التي سيتم الجمع منها بحيث لا تكون مزدحمة للغاية. تحت مجهر التشريح، استخدم ملاقط فائقة الدقة للإمساك بخطاطيف الفم وزوجًا آخر للإمساك بثلثي طول الجسم. ثم اسحب خطاطيف الفم برفق للكشف عن الدماغ، والعقد العصبية البطنية، والغدد اللعابية، وأجزاء من الجهاز الهضمي.

بعد ذلك، استخدم الملقط لفصل الدماغ والعقد البطنية عن الأنسجة الأخرى وانقلها إلى قطرة من محلول XPBT على طبق بلاستيكي. بالنسبة لتشريح خصية nasia، اجمع صغار puy في عمر ثلاثة أيام. يتميز صغار puy في عمر ثلاثة أيام بوجود أجسام صفراء وعيون حمراء.

تعتبر تلك التي تمتلك وسائد أجنحة أصغر ذكوراً. أمسك العذراء من أعلى البطن بالقرب من المنطقة الصدرية باستخدام ملقط واحد، وباستخدام ملقط ثانٍ، أمسك الطرف القاصي جداً من البطن، ثم اسحب الخصيتين اللتين تتخذان شكل قطرة الدمع.

تكون الخصيتان محاطتين بأجسام دهنية يمكن إزالتها عن طريق الرج اللطيف؛ قم بفصل أي أجزاء خارجية من الخصيتين، حيث إن وجودها سيمنع عملية الهرس الصحيحة، ثم انقل الخصيتين إلى قطرة من XPBT على شريحة نظيفة. وبمجرد جمع جميع الأنسجة، عالجها بمحلول ناقص التوتر لتحسين فصل الكروماتيدات الشقيقة. وفي المناطق الكروماتينية، انقل الأنسجة إلى قطرة من سترات الصوديوم بتركيز 0.5% لمدة 10 دقائق.

لتحقيق هذا التأثير، لا يُوصى باستخدام الكولشيسين (colchicine) لأنه قد يسبب تشوهات في شكل الكروموسومات. الآن، قم بتثبيت الأنسجة باستخدام ملاقط دقيقة للغاية. انقلها إلى قطرة بحجم 20 µL من محلول 2.5% PFA المحضر حديثاً في 45% حمض الأسيتيك (acetic acid) على شريحة غطاء معالجة بطبقة sigma coat نظيفة؛ وزع الأنسجة بشكل متساوٍ في المثبت واتركها لتحضن لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم ابدأ بعملية سحق شرائح الغطاء. ابدأ بوضع شريحة مطلية بالبولي-لايسين (polylysine) برفق بحيث يكون وجهها لأسفل فوق النسيج وشريحة الغطاء.

اترك شريحة التغطية تلتصق بالجانب السفلي من الشريحة دون ضغط. يساعد معالجة شرائح التغطية بـ sigma coat في ضمان بقاء النسيج المهروس على الشريحة بعد إزالة شريحة التغطية. ومع ذلك، قد يظل النسيج ملتصقاً بشريحة التغطية في حالات نادرة.

خلال هذه الخطوة، نوصي بإجراء عمليات هرس متكررة للأنسجة. الآن اقلب الشريحة وضعها داخل قطعة مطوية من الورق المقوى. بعد ذلك، وعلى سطح مستقر، استخدم إبهامك للضغط بقوة شديدة وبشكل عمودي مباشرة فوق غطاء الشريحة.

تجنب الضغط بطريقة تؤدي إلى انزلاق الغطاء، لأن ذلك سيتسبب في تلطخ النسيج. عادةً ما يؤدي الضغط القوي جداً إلى الحصول على كروموسومات واضحة ومحددة جيداً داخل النسيج المهروس. ومع ذلك، قد تواجه في بعض الأحيان تبايناً في جودة الكروموسومات، مثل الكروموسومات غير المكتملة، أو المهروسة، أو المجزأة.

لذا، نوصي مجدداً بإجراء عمليتي أو ثلاث عمليات تكرارية لسحق الأنسجة. انقل التجميعة إلى كتلة من الجليد لبضع دقائق، ثم اغمرها في النيتروجين السائل حتى يتوقف غليان النيتروجين أو لفترة أطول. بعد إخراج الشريحة مباشرة قبل ذوبان الأنسجة، استخدم شفرة حلاقة جديدة لرفع زاوية غطاء الشريحة، وبذلك يتم إزالته.

احرص على تجنب خدش النسيج. ثم ضع الشريحة بسرعة في جرة كوبلن مملوءة بـ 100% ethanol، واتركها تنقع لمدة خمس دقائق على الأقل. أخرج الشريحة وقم بامتصاص الإيثانول الزائد دون لمس النسيج، واترك الشريحة لتجف في الهواء لمدة ساعة.

يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح لأسابيع إلى أشهر في غرفة تجفيف. ابدأ بإضافة 100 nanograms من كل مسبار إلى 20 microliters من محلول التهجين بتركيز 1.1 x للحصول على محلول بحجم 22 microliter من محلول التهجين بتركيز one x. ثم انقل الخليط بواسطة الماصة إلى النسيج المثبت، مع ترك النسيج دون لمس، ثم ضع غطاء الشريحة برفق.

لن تسبب فقاعة هوائية صغيرة لا تلامس النسيج أي مشاكل، ولكن وجود المزيد من الفقاعات يستدعي إعادة وضع غطاء الشريحة. ضع الشريحة على الجانب المسطح من كتلة تسخين بدرجة حرارة 95 degrees Celsius وقم بتغطيتها بورق القصدير. انتظر لمدة خمس دقائق، يمكنك خلالها تحضير غرفة الرطوبة عن طريق إضافة مناشف ورقية مبللة إلى صندوق الرؤوس.

ثم قم بإزالة الشريحة. غلف الشريحة بعناية ببارافورم ممدود وانقلها إلى غرفة ترطيب تتكون من منشفة رطبة في صندوق رؤوس الماصات، ثم حضن الشريحة في الغرفة لمدة تتراوح من أربع ساعات إلى ليلة كاملة عند 30 degrees Celsius. وتعد درجة الحرارة هذه مناسبة للمسابير ذات محتوى GC المنخفض، ولكن بالنسبة للمسابير ذات محتوى GC الأعلى، قد يتطلب الأمر بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها فيما يتعلق بدرجات حرارة التهجين.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة غشاء البارافيلم بعناية وارفع غطاء الشريحة ببطء من أحد أركانه. ثم اغسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام محلول 0.1 XSSC المنظم لمدة 15 دقيقة لكل غسلة. غطِّ الوعاء برقائق الألومنيوم أثناء عمليات الغسل لتقليل التعرض للضوء.

بالنسبة للمجسات المبيوتينية الطويلة، أضف rod domine avadon واغسلها قبل المتابعة. أولاً، جفف المنطقة المحيطة بالنسيج وغطِّ النسيج بـ 100 µL من محلول الحجب. ثم ضع غطاءً زجاجياً جديداً برفق دون حبس فقاعات هوائية.

مرة أخرى، غلف الشريحة بـ param. ثم قم بتحضين الشريحة عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. ثانياً، بعد التحضين، قم بإزالة غطاء الشريحة وتجفيف المنطقة المحيطة بالنسيج باستخدام منديل.

بعد ذلك، ضع 100 µL من rumine avadon بتركيز 1:1000 مخفف في SBT على النسيج. ثم قم بتغطية الشريحة وتغليفها وتحضينها كما فعلت مع القطعة الشمعية. وأخيراً، قم بإزالة غطاء الشريحة بعناية واغسل الشريحة.

استخدم ثلاث غسلات في محلول 4 x SSCs T، تليها ثلاث غسلات في محلول 0.1 XSSC. يجب أن تستغرق كل خطوة غسيل خمس دقائق على الأقل. وبالمتابعة في البروتوكول، جفف الشرائح عن طريق تجفيف المحلول المنظم الزائد دون لمس النسيج.

بعد ذلك، ضع الشريحة بحيث يكون جانب النسيج للأعلى في مكان مظلم لمدة 10 إلى 15 دقيقة أو حتى يتلاشى الترطيب تماماً. الآن، قم بتثبيت الشريحة باستخدام 11 µL من vector shield مع DPI وأنزله بعناية على غطاء شريحة غير مطلي بـ sigma coat. إذا لم يصل الوسط إلى جميع الحواف، أضف بضعة ميكرولترات إضافية من الوسط من الحافة وامسح أي زيادة.

بعد ذلك، يتم إغلاق غطاء الشريحة باستخدام طلاء الأظافر وتخزين الشريحة بوضع عمودي في مكان مظلم حتى يجف طلاء الأظافر، وهو ما يستغرق عادةً نصف ساعة على الأقل. ثم تُخزن الشريحة عند درجة حرارة -20 °C لمدة تصل إلى أسبوع، ويتم تصوير النسيج في أقرب وقت ممكن. تم تهجين مجموعة من قليلات النيوكليوتيد (oligos) الصغيرة المُصنعة تجارياً والمقترنة بمركبات فلورية، ومسبار أطول مُبَيوتَن (biotinylated) تم تحضيره بواسطة ترجمة نيك (Nick Translation)، بكروموسومات من عدة أنواع مختلفة من الأنسجة.

باستخدام المنهجية الموصوفة، تعرف المسبار الخاص بتكرار الساتلايت المكون من 359 زوجاً قاعدياً في Drosophila Melanogaster على كتلة كبيرة متعددة الميجا زوج قاعدي على الكروموسوم x ومنطقة أصغر بكثير على الكروموسوم الثالث. واكتشف مسبار أطول ضد ساتلايت المستجيب كتل تكرار تتكون من أعداد نسخ تكرار منخفضة نسبياً تبلغ حوالي 700. وبالتالي، تسمح هذه الطريقة بتصور كتل ساتلايت صغيرة جداً.

عندما تمت مضاعفة مدة خطوة المعالجة بالمحلول منخفض التوتر إلى 10 دقائق، زاد تباعد الكروماتيدات الشقيقة بشكل ملحوظ. يمكن دمج هذا الإجراء مع طرق أخرى مثل التلوين بالأجسام المضادة للإجابة على تساؤلات مثل ما إذا كانت بروتينات كروماتينية معينة تتوضع في تسلسلات محددة.