تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

الهدف العام من التجربة التالية هو التمييز بين mRNAs عالية الترجمة وضعيفة الترجمة من خلال تثبيت وفصل متعدد الريبوسومات (polyribosomes). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضافة cyclo heximide إلى الخلايا لتثبيط حركة الريبوسومات وانتقالها وترجمة RNA. وفي خطوة ثانية، يتم تحميل نواتج تحلل الخلايا المعالجة على تدرج سكروز واستخدام جهاز الطرد المركزي الفائق لفصل متعدد الريبوسومات المخزنة وفقاً لكتلها.

بعد ذلك، يتم تقسيم التدرج إلى أجزاء متساوية لفصل النسخ ذات الكفاءة العالية والمنخفضة في الترجمة في الخطوة النهائية. ويُستخدم R-T-Q-P-C-R للكشف عن وجود mRNAs المستهدفة داخل كل جزء. وفي النهاية، يمكن استخدام تحليل تعريف الريبوسومات (ribosome profiling) للكشف عن التغيرات في الترجمة الشاملة والنوعية لـ mRNA استجابةً لضغوط فيزيولوجية وفيزيوباثولوجية متميزة.

يمكن أن يجيب تحليل PolyOne على أسئلة رئيسية في مجالات البيولوجيا الجزيئية والخلوية، مثل تحديد أي mRNAs يتم اختيارها وترجمتها أثناء الإجهاد S، وكيف يسمح ذلك للخلايا بالتكيف مع هذه الظروف. يوضح هذا الإجراء طالب دراسات عليا في المختبر. لاستخدام صانع تدرج آلي لتحضير تدرج السكروز، ابدأ بتشغيل صانع التدرج وقم بتسوية اللوحة التي ستحمل التدرجات؛ وعندما يتم تسوية اللوحة، انقر على تم.

بعد ذلك، لاختيار برنامج التدرج، افتح قائمة grad وحدد القائمة (list). انقر على SW 41 ثم تصفح القائمة حتى يظهر برنامج التدرج من 10 إلى 50% بـ 11 خطوة، ثم اضغط على Use. بعد ذلك، ضع أنبوب طرد مركزي فائق مخروطي SW 41 في كتلة العلامات، واستخدم علامة الأنابيب الدقيقة المرفقة لرسم خط على الأنبوب بمحاذاة الخطوة العلوية للكتلة.

ضع الأنابيب في حامل مناسب على سطح مستقر، ثم قم بتوصيل الكانيولتين المرفقتين بمحقنتين سعة 10 milliliter. اسحب الماء المقطر الدافئ الذي يحتوي على RNAs في محلول التنشيط داخل المحاقن وخارجها لعدة مرات لغسل المحاقن. بعد ذلك، وبعد إزالة كافة آثار الماء، املأ إحدى المحاقن بمحلول 10%sucrose مضافاً إليه cyclo heide، وأدخل الكانيولا في قاع أنبوب جهاز الطرد المركزي الفائق.

قم بتفريغ المحلول برفق حتى يتجاوز العلامة الموضوعة على الأنبوب بقليل، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات. ثم املأ المحقنة الأخرى بـ 50%sucrose مضافاً إليها cyclo heide، ونظف أي سائل زائد عن الأنبوب باستخدام منديل مسح.

استخدم الكانيولا لإدخال محلول السكروز بنسبة 50% برفق في الأنبوب، والتوقف عندما يصل المحلول إلى مستوى العلامة، ثم قم بإزالة الكانيولا بسرعة وسلاسة. يجب أن يرتفع محلول السكروز بنسبة 10% ليشكل سطحاً مقعراً عند قمة الأنبوب. بعد ذلك، قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي الفائق قليلاً لإزاحة أي فقاعات هوائية، ثم ضع الغطاء واستخدم ماصة دقيقة (micro pipette) لإزالة أي سائل زائد في خزان الغطاء.

ضع الأنابيب على جهاز صنع التدرج ثم اضغط على زر التشغيل. لاحظ أن اللوحة ستميل بالزاوية المحددة. انتظر لمدة خمس ثوانٍ، ثم ستبدأ الدورات لتشكيل التدرج.

بعد مرور دقيقتين تقريبًا، سيصدر الجهاز صوت تنبيه يشير إلى اكتمال تكوين التدرج. انقل الأنابيب برفق إلى حامل وأزل الأغطية بسرعة في حركة واحدة للأعلى لتجنب تعكير التدرج. بعد ذلك، قم بتحميل 260 وحدة من مستخلص الخلايا المُحضّر مسبقًا بدقة على كل تدرج سكروز، ثم قم بدوران الأنابيب لمدة ساعة ونصف بسرعة 260,343 ×g ودرجة حرارة 4 °C في جهاز طرد مركزي فائق.

لإعداد جهاز نظام التجزئة بالتدرج، ابدأ بتشغيل مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك، انقر على أيقونة المجلد مرتين ثم سهم الرجوع مرتين للعودة إلى الشاشة الرئيسية، وقم بضبط مجمع الأجزاء على طريقة PolyZone لضمان ضبط الصمام في مجمع الأجزاء على وضع الفضلات. انقر على السهم الذي يشير إلى أيقونة سلة المهملات، ثم ضع دورق MIA سعة 250 milliliter يحتوي على ماء مقطر أسفل أنبوب تجميع الفضلات.

الآن، حدد الإعدادات التالية في مسجل المخططات: اضبط قرص الحساسية لضبط المصباح والبصريات، ومفتاح مرشح الضوضاء على 1.5، وقرص فاصل القمم على وضع الإيقاف (off)، وقرص سرعة المخطط على 30 centimeters per hour، وقرص ضبط خط الأساس الموجود أعلى وحدة spectrophotometer على الحد الأقصى للفتح. بعد ذلك، ضع المحقنة والأسطوانة في المضخة واستخدم البراغي ومفتاح Alan Key المرفقين لتثبيتهما في مكانهما.

استخدم أمر العكس (rev) بسرعة عالية لملء المحقنة بمحلول المطاردة. ثم ضع المضخة في الوضع القائم واستخدم أمر التقديم (forward) لطرد الهواء عبر الأنابيب. بعد ذلك، ثبّت أنبوب طرد مركزي فائق مملوء بماء خالٍ من الـ RNAs في الحامل، ثم اغرز الكانيولا في الأنبوب حتى تظهر العلامتان السوداوان.

تقع فتحة التوزيع بين العلامتين. ابدأ تشغيل مضخة السرنجة في الوضع اليدوي الأمامي بمعدل 6.0 milliliters per minute. وعندما يملأ محلول الدفع ثلث الأنبوب، قم بتحويل السرعة إلى المتغيرة بمعدل تدفق قدره 1.0 milliliters per minute.

قم الآن بتدوير قرص ضبط الخط القاعدي في جهاز قياس الطيف الضوئي حتى تصل القيمة الجهدية في المخطط إلى الصفر. سيبدأ الماء بالخروج من أنبوب التصريف إلى دورق el Mya. ثم اضبط الحساسية المطلوبة على 1.0 au.

بعد ضبط الحساسية، اضغط على زر baseline (الخط القاعدي) وأدر قرص إزاحة المسجل (recorder offset dial) لضبط إعداد الخط القاعدي عند علامة 10% على مسجل المخططات. وبمجرد تحقيق خط قاعدي مستقر، قم بإيقاف تشغيل مفتاح المضخة وقرص سرعة المخطط. بعد إيقاف المضخة، قم بتحويلها إلى وضع rev (العكس) لاستعادة محلول المطاردة حتى يصل إلى العلامة الأولى على كانيولا الثقب.

بعد ذلك، قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي، وقم بتشتيت أي فقاعات موجودة في الكانيولا باستخدام كمية قليلة من محلول المطاردة، ونظف أي مياه متبقية قد تكون تسربت من خلية التدفق لتقسيم التدرج. بعد ذلك، قم بتركيب أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على تدرج السكروز في الحامل واثقب الأنبوب بالكانيولا. ثم ضع عشرة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 mL في مواضع صينية جامع الكسور من 2 إلى 11، وضع أنبوب نفايات في الموضع 1 بحيث لا تبرز الأغطية للأعلى.

اضبط قرص التحكم في المضخة على الوضع اليدوي ومعدل التدفق في مضخة الحقنة على 6.0 milliliters per minute. ثم اضغط على زر التشغيل في جامع الكسور بمجرد وصول الذراع إلى الأنبوب الأول. اضغط على زر الإيقاف المؤقت لتحديد موضع الذراع وفتح صمام توزيع الكسور.

بعد ذلك، استخدم أمر التشغيل الأمامي (forward) لبدء عمل المضخة وراقب قلم مسجل المخططات. عندما يبدأ القلم في الانحراف للأعلى، مما يشير إلى مرور العينة عبر خلية التدفق، استبدل أنبوب النفايات بسرعة بالأنبوب رقم واحد. ثم عند جمع القطرة الأولى، قم بتحويل الأوامر بسرعة إلى بدء التشغيل عن بعد (remote start)، والإيقاف (stop)، والقيمة المتغيرة 1.0 milliliters per minute، واضغط على زر التشغيل (play) للسماح لواجهة جامع الكسور بجمع كسور بحجم one milliliter كل دقيقة.

أخيراً، بعد دخول محلول المطاردة الأزرق إلى الأنبوب الأخير، اضغط على إيقاف. يُعد تحليل PolyZone تقنية أساسية لإثبات الدور المحدد لـ PD CD4 في عملية الترجمة التي تتوسطها IRAs. على سبيل المثال، في هذه التجربة، تم تحويل خلايا HEC 2 93 عابراً لاستنفاد المستويات الداخلية لـ PDC D four، ثم خضعت لتحليل PolyZone profile.

لم يؤدِ تقليل مستويات PDC D four إلى إعاقة الترجمة العامة للجين، كما استُدل على ذلك من عدم حدوث تغييرات في ملف PolyZone. وعند مقارنة الخلايا الضابطة SI والخلايا المعالجة بـ IPD CD four، تبيّن أن توزيع البوليسومات لمتغير XIAP غير المحتوي على IREs ظل دون تغيير بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة. وفي المقابل، حدث تغير ملحوظ في توزيع البوليسومات لـ mRNAs التي تحمل IS لكل من XIAP و BCL XL.

في حالة غياب PD CD4، انزاحت توزيعات هذين النوعين من mRNA نحو الريبوسومات الثقيلة. وبما أن هذا لم يصاحبه تغيرات في مستويات الحالة المستقرة لـ mRNA الخاص بـ XIAP و BCL XL، فإن هذه النتائج تثبت تعزيز ترجمة XIAP و BCL XL في الخلايا التي تعاني من انخفاض مستويات PDC D four، وهو ما تم تأكيده لاحقاً عن طريق Western blossoming. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية قياس ترجمة mRNA من خلال تحضير sucrose region وفصل polysome بواسطة ultracentrifugation.