تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

الهدف العام من التجربة التالية هو التمييز بين mRNAs المترجمة بشكل كبير وضعيف عن طريق تثبيت وفصل البولي ريبوسومات. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة cyclo heide أولا إلى الخلايا لتثبيط الريبوسوم والانتقال وترجمة الحمض النووي الريبي. كخطوة ثانية ، يتم تحميل المحللات من الخلايا المعالجة على تدرج السكروز وجهاز طرد مركزي فائق لفصل البولي ريبوسومات المخزنة وفقا لكتلها.

بعد ذلك ، يتم تقسيم التدرج إلى كسور متساوية لفصل النصوص المترجمة بشكل كبير وضعيف في الخطوة النهائية. يستخدم R-T-Q-P-C-R للكشف عن وجود الرنا المرسال محل الاهتمام داخل كل كسر. في النهاية ، يمكن استخدام توصيف الريبوسوم للكشف عن التغيرات في الترجمة العالمية وكذلك الترجمة المحددة ل mRNA استجابة للضغوط الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية المتميزة.

يمكن أن يجيب توصيف PolyOne على الأسئلة الرئيسية في مجالات البيولوجيا الجزيئية والخلوية مثل mRNAs التي يتم اختيارها وترجمتها أثناء الإجهاد S ، وكيف يسمح ذلك للخلايا بالتكيف مع هذه الظروف. يوضح هذا الإجراء أمي دار لطالب دراسات عليا في المختبر لاستخدام صانع التدرج الآلي لإعداد تدرج السكروز ، ابدأ بتشغيل صانع التدرج وتسوية اللوحة التي ستحمل التدرجات عند تسوية اللوحة. انقر فوق تم.

ثم لتحديد برنامج التدرج ، افتح قائمة التدرج وحدد القائمة. انقر فوق SW 41 ثم قم بالتمرير عبر القائمة حتى يتم عرض برنامج 11 خطوة متدرجة من 10 إلى 50٪ واضغط عليها. استخدام. بعد ذلك ، ضع أنبوب طرد مركزي فائق مخروطي SW 41 في كتلة العلامة واستخدم علامة الأنبوب الدقيقة المتوفرة لتتبع خط على الأنبوب على طول الخطوة العلوية من الكتلة.

ضع الأنابيب في رف تركيب على سطح ثابت ، ثم قم بإرفاق القنيات المتوفرة بحقنتين سعة 10 مل. الماء المقطر الدافئ الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي في محلول التنشيط لأعلى ولأسفل عدة مرات لغسل المحاقن. ثم بعد إزالة جميع آثار الماء ، املأ إحدى المحاقن بنسبة 10٪ من السكروز بالإضافة إلى cyclo heide ، وأدخل القنية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق.

استغني عن المحلول برفق حتى يتجاوز العلامة الموجودة على الأنبوب. الحرص على تجنب الفقاعات. ثم املأ المحقنة الأخرى بنسبة 50٪ من السكروز بالإضافة إلى cyclo heide ، ونظف أي سائل إضافي من الأنبوب بمسح.

استخدم القنية لإدخال محلول السكروز بنسبة 50٪ برفق في الأنبوب ، وتوقف عندما يكون المحلول مستويا مع العلامة ثم قم بإزالة القنية بسرعة وسلاسة. يجب أن يرتفع محلول السكروز بنسبة 10٪ لتشكيل الغضروف المفصلي في الجزء العلوي من الأنبوب. بعد ذلك، قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي الفائق قليلا لإزاحة أي فقاعات هواء وأدخل الغطاء باستخدام ماصة صغيرة لإزالة أي سائل زائد في خزان الغطاء.

ضع الأنابيب على صانع التدرج ثم اضغط على زر التشغيل. لاحظ أن اللوحة ستميل بالزاوية المحددة. توقف مؤقتا لمدة خمس ثوان ، ثم ستبدأ الدورات لتشكيل التدرج.

بعد حوالي دقيقتين ، ستصدر الماكينة صوتا للإشارة إلى اكتمال تكوين التدرج. انقل الأنابيب برفق إلى الرف وقم بإزالة الأغطية بسرعة عند الحركة الصعودية لتجنب إزعاج التدرج. ثم قم بتحميل 260 وحدة من محللة الخلية المعدة مسبقا برفق على كل تدرج سكروز ، وقم بتدوير الأنابيب لمدة ساعة ونصف عند 260 ، 343 مرة G وأربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي فائق.

لإعداد أداة نظام تجزئة التدرج ، ابدأ بتشغيل مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، اختر رمز المجلد مرتين ثم سهم الإرجاع مرتين للعودة إلى الشاشة الرئيسية ولضبط مجمع الكسور على طريقة PolyZone لضمان ضبط الصمام الموجود على مجمع الكسر على النفايات. انقر فوق السهم الذي يشير إلى أيقونة سلة المهملات ثم ضع قارورة MIA سعة 250 مليلتر تحتوي على ماء مقطر أسفل أنبوب تجميع النفايات.

حدد الآن الإعدادات التالية على مسجل الرسم البياني قرص الحساسية لضبط المصباح والبصريات مرشح الضوضاء. قم بالتبديل إلى 1.5 قرص فاصل الذروة لإيقاف سرعة الرسم البياني ، واطلب إلى 30 سم في الساعة وخط الأساس واضبط القرص أعلى وحدة مقياس الطيف الضوئي لأقصى فتح. ثم ضع المحقنة والبرميل في المضخة واستخدم البراغي المرفقة ومفتاح آلان لإحكام ربطها في مكانها.

استخدم أمر rev بسرعة عالية لملء المحقنة بمحلول المطاردة. ثم ضع المضخة في الوضع الرأسي واستخدم الأمر الأمامي لمطاردة الهواء عبر الأنبوب. بعد ذلك ، قم بتثبيت أنبوب طرد مركزي فائق مملوء بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي في الحامل ، ثم اخترق الأنبوب بالقنية حتى تظهر العلامتان الأسودان.

ثقب الاستغناء بين العلامتين. ابدأ مضخة المحقنة يدويا أماميا بمعدل 6.0 مل في الدقيقة. عندما يملأ محلول المطاردة ثلث الأنبوب ، قم بالتبديل إلى السرعة إلى متغيرة بمعدل تدفق يبلغ 1.0 مل في الدقيقة.

الآن قم بتدوير قرص ضبط خط الأساس على مقياس الطيف الضوئي حتى يصبح الجهد على الرسم البياني عند الصفر. سيبدأ الماء في الخروج من أنبوب النفايات إلى قارورة el Mya. ثم اضبط الحساسية المطلوبة على 1.0 وحدة فلمية.

عند ضبط الحساسية ، اضغط أيضا على زر خط الأساس وأدر قرص إزاحة المسجل لضبط إعداد خط الأساس على علامة 10٪ على مسجل الرسم البياني. ثم بمجرد تحقيق خط الأساس المستقر ، قم بإيقاف تشغيل مفتاح المضخة وقرص سرعة الرسم البياني للتشغيل. بمجرد إيقاف تشغيل المضخة ، قم بتبديلها إلى موضع الدوران لاستعادة محلول المطاردة حتى تصل إلى العلامة الأولى على القنية الخارقة.

ثم قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي ، وقم بتفريق أي فقاعات في القنية بمحلول مطاردة صغير ، وقم بتنظيف أي مياه متبقية قد تكون قد تسربت من خلية التدفق لتجزئة التدرج. بعد ذلك ، قم بتثبيت أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على تدرج السكروز في الحامل وثقب الأنبوب بالقنية. ثم ضع عشرة أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة ملليلتر في مواضع صينية تجميع الكسر من اثنين إلى 11 وأنبوب الخصر في الموضع الأول بحيث لا تبرز الأغطية لأعلى.

اضبط قرص التحكم في المضخة على يدوي ومعدل التدفق على مضخة الحقنة على 6.0 ملليلتر في الدقيقة. ثم اضغط على تشغيل على مجمع الكسور بمجرد وصول الذراع إلى الأنبوب الأول. اضغط على زر الإيقاف المؤقت لوضع الذراع وفتح صمام توزيع الكسر.

ثم استخدم الأمر الأمامي لبدء تشغيل المضخة ومراقبة قلم مسجل المخطط. عندما يبدأ القلم في الانحراف لأعلى ، مما يشير إلى أن العينة تمر عبر خلية التدفق ، استبدل أنبوب النفايات بسرعة بالأنبوب رقم واحد. ثم عندما يتم جمع القطرة الأولى ، قم بتبديل الأوامر بسرعة إلى بدء التشغيل عن بعد والإيقاف وتغيير 1.0 ملليلتر في الدقيقة واضغط على تشغيل للسماح لواجهة مجمع الكسور بجمع كسور مليلتر واحدة كل دقيقة.

أخيرا ، بعد دخول محلول المطاردة الأزرق إلى الأنبوب الأخير ، اضغط على إيقاف. يعد التنميط PolyZone تقنية رئيسية لإثبات المشاركة المحددة ل PD CD4 في الترجمة بوساطة IRAs. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، تم نقل خلايا HEC 2 93 بشكل عابر لاستنفاد المستويات الداخلية ل PDC D four ، ثم خضعت لتحليل ملف تعريف PolyZone.

يضعف تقليل مستويات PDC D four الترجمة العالمية للجين كما هو محكوم عليه من خلال عدم وجود تغييرات في ملف تعريف PolyZone. عند مقارنة التحكم في SI و IPD CD ، لم يتغير توزيع الخلايا المتعددة للجدولة لمتغير غير IRAs من XIAP بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة. في المقابل ، تم تغيير توزيع متعدد الجسيمات لاثنين من أنظمة IS التي تؤويان mRNAs XIAP و BCL XL بشكل كبير.

في غياب PD CD4 ، تم تحويل توزيع هذين المرسال إلى ريبوسومات ثقيلة. نظرا لأن هذا لا يصاحبه تغييرات في مستويات الحالة المستقرة ل XIAP و BCL XL mRNA ، فإن هذه النتائج توضح الترجمة المحسنة ل XIAP و BCL XL في الخلايا ذات المستويات المنخفضة PDC D الأربعة كما أكد الإزهار الغربي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس ترجمة الرنا المرسال عن طريق تحضير منطقة السكروز وفصل البولي سوم عن طريق الطرد المركزي الفائق.