العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل خلايا العضلات النقية من خزعات عضلات المريض البشري وتخليدها لدراسات المصب. يتم تحقيق ذلك عن طريق وزن الأنسجة المجمعة أولا وفرمها وهضمها لفصل الخلايا أحادية النواة. كخطوة ثانية ، يتم تنقية الخلايا العضلية من الخلايا غير العضلية بالحقائق.

بعد ذلك ، تصاب الخلايا العضلية بكل من CDK four و H turt لتوليد خلايا خالدة. تظهر النتائج أنه يمكن توسيع خلايا العضلات الحية المشتقة من المريض لعدة مقاطع وتمايزها بناء على فحوصات اندماج الخلايا ، ووجود أنابيب عضلية ارتعاش ، والتعبير عن علامات عضل المنشأ. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى ما هو أبعد من تشخيص أمراض العضلات لأنها يمكن أن توفر عددا غير محدود من الخلايا العضلية لفحص الأدوية أو غيرها من التطبيقات النهائية حيث يلزم وجود عدد كبير من الخلايا.

سأعرض الإجراء مع جيروم روبن ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبر الدكتور وودي رايت في دالاس. ابدأ بفصل خزعة العضلات لتنقية الخلايا العضلية المنشأ. أولا في غطاء السلامة الحيوية لزراعة الأنسجة ، سجل كتلة خزعة العضلات.

بعد ذلك في طبق 10 سم ، استخدم مشارط معقمة لفرم الأنسجة إلى قطع مفرومة ناعما. أضف بضع قطرات من X-H-B-S-S حتى لا يجف النسيج لكل جرام من الأنسجة. أضف 3.5 مل من معجون القرص اثنين و 3.5 مل من محاليل الكولاجيناز D.

ثم امزج الخلايا بماصة سعة 25 ملليلتر وانقل اللوحة إلى حاضنة كل 15 دقيقة. امزج الخلايا بماصة سعة خمسة ملليلتر في غضون 90 دقيقة. يجب أن يكون هناك تفكك كامل للأنسجة.

بمجرد فصل الأنسجة ، أضف مجلدين من وسائط النمو وقم بتصفيتها من خلال مصفاة 100 ميكرون. اجمع المرشح في أنبوب سعة 50 مل. قم بتكسير الخلايا من المرشح عند 329 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم أعد تعليق الخلايا في HBSS مع 0.5٪ BS و A ، وقم بحسابها. اضبط مستوى الصوت للحصول على 1 مليون خلية لكل 100 ميكرولتر. ضع جانبا 250،000 حصة خلية كعنصر تحكم غير ملوثة وخصص اثنين من الحصص المتشابهة للتحكم في البقعة الفردية.

كل هذه مطلوبة لتحليل الفاكس. الآن ، قم بتلطيخ الخلايا بخمسة ميكرولترات من الجسم المضاد ل CD 56 لكل مليون خلية ، واحتضان جميع العينات على الجليد لمدة نصف ساعة. بعد ذلك ، اغسل العينات بسرعة باستخدام 10 مل من HBSS.

ثم قم بتكسير الخلايا كما كان من قبل ، ولكن عند أربع درجات مئوية بعد تكوير الخلايا ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في X-H-B-S-S بمعدل 5 ملايين خلية لكل مليلتر. ثم أضف يوديد البروبيديوم إلى التركيز النهائي البالغ ميكروغرام واحد لكل مليلتر. الآن قم بتنقية الخلايا الإيجابية CD 56 العضلية من الخلايا غير العضلية باستخدام الحقائق التي تتبع لوحة التنقية.

الخلايا العضلية في 50 ، 000 لكل بئر في ستة ألواح جيدة مغلفة بثقافة الجيلاتين 0.1٪ ، الخلايا حتى يتم ربطها ، ثم تصيبها بالفيروس لخط الخلية الخالد. في بروتوكول النص ، هناك مراجعة إضافية لكيفية تنقية الخلايا الليفية الجلدية وزراعتها كما هو موضح في بروتوكول النص. تحضير الخلايا الاستوائية للطائر الفينيق بعد احتضان الخلايا الاستوائية في العنقاء طوال الليل بخليط البلازميد PolyJet.

تغذية الخلايا طازجة ومتوسطة وتتكون من أربعة أجزاء من DME M1 ، جزء من مصل متوسط ، 1 99 و 10٪. قم أيضا بإعداد عبوات تقلص المؤثرة. PA ثلاث خلايا 17 في ستة صفيحة آبار مع حوالي 400،000 السلطة الفلسطينية ثلاث 17 خلية لكل بئر.

بعد 12 ساعة ، اجمع الفيروس الذي يحتوي على مادة طافية فوق خلايا فينيكس الاستوائية وقم بتمريره عبر مرشح 0.45 ميكرون. ثم استخدم ملليلترا واحدا من المادة الطافية لإصابة الخلايا المتقدمة بثلاث خلايا 17 وزرعتها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، حدد خط خلوي منتج للفيروس من PA ثلاث خلايا 17 عن طريق تطبيق المضادات الحيوية بمعدل 0.5 ملليغرام لكل مليلتر على الوسط عندما تكون الخلايا قريبة من الطلاقة المشتركة ، وحصاد المادة الطافية من الخلايا ثلاث مرات على فترات 12 ساعة.

قم بتصفية المجموعات بعد كل حصاد. المرشح هو المادة الطافية الفيروسية العاملة. قسمها إلى مليلتر واحد. Aliquots.

ضع جانبا بعض الحصص للاستخدام الفوري. يمكن تخزين الحصص الإضافية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، ولكنها ستفقد كفاءة بنسبة 50٪ مع كل دورة ذوبان تجميد. لاحظ أنه طوال العملية ، يجب غسل المعدات التي لامست الجزيئات الفيروسية بالتبييض قبل التخلص منها في سلة المهملات.

لتخزين خط الخلايا المستقرة PA ثلاثة 17 منتجا للفيروسات بشكل دائم ، قم بتجميد الخلايا في مصل 10٪ DMSO 90٪ وقم بتخزينها عند 150 درجة مئوية تحت الصفر لكل بئر من الخلايا المنقاة بالفاكس. في طبق مكون من ستة آبار ، أضف 400 ميكرولتر من المادة الطافية الفيروسية المنتجة حديثا. اترك بئرين بدون فيروس كضوابط.

احتضان اللوحة بين عشية وضحاها وفي اليوم التالي قم بتغيير الوسط في كل بئر إلى 2.5 مل من وسائط العضلات الطازجة. تأكد من التخلص من الوسائط والماصات التي تحتوي على جزيئات فيروسية في حاوية التبييض. دع الخلايا تحتضن في وسط العضلات الطازجة لمدة ثلاثة أيام.

ثم حدد الخلايا لمقاومة المضادات الحيوية باستخدام 400 ميكروغرام من النيومايسين لكل مليلتر لعدوى CDK الأربعة ، أو 300 ميكروغرام من الهيغروميسين لكل مليلتر للتيلوميراز البشري. عدوى النسخ العكسي لمدة أسبوع أو أسبوعين. حافظ على الخلايا في ظل الظروف الانتقائية حتى تموت الخلايا وآبار التحكم.

قم دائما بتمرير الخلايا قبل أن تتلاقى ، حتى أثناء الاختيار عندما تصل إلى 60 إلى 80٪ من الطلاقة باستخدام محلول EDTA 0.05٪ تريبسين لجمع الخلايا وتمريرها. مرر الخلايا إلى أطباق 10 سم مع أرومة عضلية طازجة ، متوسطة مع المضادات الحيوية. أولا ، قم بزرع الخلايا بكثافة منخفضة جدا من ثلاثة إلى 500 لكل طبق 10 سنتيمترات.

حافظ على الخلايا في هذه الأطباق لمدة أسبوعين تقريبا حتى تتشكل مستعمرات صغيرة من 10 إلى 20 خلية عندما تكون المستعمرات الصغيرة واضحة. قم بإزالة معظم الوسائط مع ترك طبقة رقيقة من الوسائط لمنع الخلايا من الجفاف. الآن ، اغمس جانبا واحدا من حلقة الاستنساخ في شحم فراغ السيليكون والحلقة فوق الاستنساخ المطلوب.

ضع حلقة مختلفة حول كل استنساخ مرغوب فيه في كل حلقة. أضف بضع قطرات من محلول التربسين EDTA. عندما يتم تقريب الخلايا ، استخدم مجهرا لشفط كل كرة من الخلايا بعناية إلى طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.

انقل كرات الخلية إلى آبار أصغر صفيحة متعددة الآبار متاحة. ثم قم بتوسيع كل استنساخ حسب الحاجة لمنع الطلاقة. باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم عزل الخلايا العضلية جنبا إلى جنب مع الخلايا الليفية والخلايا الشحمية وربما الخلايا المناعية ، ثم تم تنقيتها بالحقائق.

ثم تم تخليد الخلايا كما هو موضح باستخدام الفيروسات التي تعبر عن كيناز أربعة معتمد على السيكلين ، و CDK أربعة ، ونسخ التيلوميراز البشري العكسي h turt. كان من الأهمية بمكان إبقاء الأطباق أقل من الطلاقة المشتركة في كل خطوة حيث يمكن أن تدخل برنامج التمايز وتشكيل أنابيب ميو تقارن تكوين الأنبوب العضلي والانكماش في خلايا التحكم غير الخالدة والخلايا الخالدة. لم تظهر أي اختلافات.

تم تأكيد خلود خط الخلية من خلال قياس طول التيلومير ونشاط التيلوميرات. كان الخالد واضحا أيضا من منحنيات نمو الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل خلايا العضلات الأولية عن خزعة المريض.

تخليد الأرومة العضلية الأولية وعزل واختيار خليد المستنسخة العضلية المنشأ. لا تنس أن العمل مع الفيروس يتطلب استخدام مزرعة أنسجة معينة ونظام تهوية آمن. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تبييض كل ما يشارك في التلاعب بالفيروسات مثل الماصات والنصائح والأطباق والمحاقن والمرشحات لتجنب أي تلوث غير مرغوب فيه.

يمكن أن تكون الجسيمات الفيروسية خطرة ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.