في المختبر توصيف الوظيفي للماوس القولون والمستقيم وارد النهايات

الهدف العام من التجربة التالية هو التوصيف الوظيفي للنهايات العصبية الواردة الخارجية في مستقيم الفأر في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد القولون والمستقيم وعصب الرقبة المتصل بالحوض أو أسفل الظهر في سلسلة متصلة ووضع الأنسجة في غرفة تسجيل في المختبر كخطوة ثانية ، يتم تقسيم جذع العصب في الرقبة الحوضية أو القطنية إلى خيوط دقيقة بحيث يمكن إجراء تسجيلات فيزيولوجية كهربية أحادية الألياف من محاور عصبية فردية. بعد ذلك ، يتم تحديد النهايات العصبية الفردية للقولون والمستقيم عن طريق التحفيز الكهربائي غير المتحيز للمجالات المستقبلية وتصنيفها وظيفيا بناء على ملامح الاستجابة لثلاثة محفزات ميكانيكية متميزة.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اختبار الاستجابات للمواد الكيميائية التي تنطبق على النهايات العصبية عن طريق عزل المجال الاستقبالي بقطعة من الأنابيب النحاسية واستبدال المحلول بمحلول يحتوي على مادة كيميائية أو خليط من المواد الكيميائية. تظهر النتائج أن القولون والمستقيم في الفأر يتم تعصيبه بواسطة خمس فئات مختلفة من الحساسة للميكانيكا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حوالي 25٪ من القولون والمستقيم غير حساسة ميكانيكيا أو مستقبلات الألم الصامتة.

يتم استخدام هذه الطريقة من قبلنا ومن قبلنا الآخرين لدراسة التعصيب الحسي للقولون والمستقيم. نحن مهتمون باستخدام هذا النهج البحثي لأن العديد من اضطرابات الجهاز الهضمي مرتبطة بالحساسية أو التغيير في استثارة التعصيب الحسي. يتعلق اهتمامنا بفهم آليات التحسس برغبتنا في المساعدة في تطوير استراتيجيات علاجية قد تكون مفيدة بعد ذلك لتعديل الألم وعدم الراحة المرتبطين عادة باضطرابات الجهاز الهضمي هذه ، مثل متلازمة القولون العصبي.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب إتقان خطوات تشريح الأنسجة وتقسيم الأعصاب. الأعصاب تبتكر. يمكن أن يتلف القولون والمستقيم البعيد بسهولة أثناء التشريح.

وبالتالي ، فإن التشريح الدقيق وهناك خطوات تقسيم أمر بالغ الأهمية حقا لأولئك الذين يرغبون في تكرار هذه التجربة. مباشرة بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بتقطيعه ، وقم بقطع الغرفة الصدرية ، وثقب الأذين الأيمن ، واغمر جثة الفأر ، وحوالي نصف لتر من محلول الكرب المثلج. بعد ذلك ، قم بإزالة جميع الأحشاء بعناية باستثناء القولون وأعضاء الحوض.

ثم قم بتمرير جسم الفأر عند حوالي T 12 فوق الحجاب الحاجز الصدري بقليل وانقل نصف الجسم إلى غرفة تشريح تحتوي على محلول فقاعات مثلجة. تحت المنظار المجسم ، قم بإزالة المثانة والأعضاء التناسلية عن طريق التمرير عند تقاطعاتها إلى مجرى البول. أيضا ، قم بإزالة الشريان الأورطي الهابط حتى يتشعب في الشرايين الحرقفية المشتركة.

الآن ، حرر أعصاب الرقبة الحوضية أو القطنية من الأنسجة المحيطة. اتبع الأعصاب من خارج القمة الحرقفية إلى نقطة دخولها إلى العمود الفقري. تدخل الأعصاب الحوضية في العمود الفقري L ستة و S وتدخل الأعصاب الخشبية القطنية في T 13 و L واحد أظهر.

فيما يلي تشريح أعصاب الحوض الأيمن والأيسر. بعد ذلك ، قم بقطع تخليق العانة وقطع المفاصل الحقي اليمنى واليسرى. ثم قم بإزالة العظم الحرقفي بعد إزالة الحرقفي ، قم بتشريح القولون والمستقيم البعيد باستخدام العصب المتصل مجانا.

العصب المتصل من العضلات المحيطة والنسيج الضام. العصب عرضة للتلف الميكانيكي. لقد تحررنا من الأنسجة المحيطة به ، لذلك يجب إيلاء عناية خاصة لتجنب شد العصب أو قرصه.

ثم انقل القولون والمستقيم مع العصب المرفق إلى حجرة الأنسجة. افتح القولون والمستقيم طوليا على طول الحدود المضادة للمساريقية ووضع الجانب المخاطي للقولون والمستقيم لأعلى. ثم قم بتمديد العصب إلى حجرة التسجيل ، والتي يتم توصيلها بحجرة الحمام بواسطة ثقب وبوابة الماوس.

ضع جذع العصب على مرآة زجاجية صغيرة. المرآة محبة للماء ويلتصق بها العصب. الآن بجوار حجرة التسجيل ، قم بتثبيت الحافة المساريقية للقولون والمستقيم.

الآن قم بدمج حجرة الحمام بمحلول كريب دافئ مؤكسج واملأ حجرة التسجيل بالزيت المعدني لإكمال الإعداد. قم بتوصيل الطول المضاد للمساريقي للقولون والمستقيم بمجموعة من الخطافات المتصلة بمشغل قوة تحت المجهر الاستريو بتكبير عالي. قشر غمد العصب بعناية من عصب الحوض المعزول أو العصب القطني للعنق باستخدام ملقط دقيق.

قم بمضايقة جذع العصب إلى خمس إلى ثماني حزم عصبية يبلغ سمك كل منها حوالي 100 ميكرون. الآن ضع القطب المرجعي على اتصال بمحلول كريبس في غرفة الأنسجة. ثم ضع حزم الأعصاب الفردية بالتتابع على قطب التسجيل لاستحضار إمكانات الفعل من القولون والمستقيم.

قم بضرب سطح القولون والمستقيم برفق باستخدام فرشاة رسم ناعمة. وبالتالي تحديد الحزمة العصبية أو الحزم التي تغذي القولون. الآن باستخدام زوج من أطراف الإبرة قياس 30 ، قم بتقسيم حزمة العصب إلى خيوط بسمك 10 ميكرون ووضع أحد الخيوط على قطب التسجيل.

تتطلب هذه الخطوة مستوى عال من تنسيق العين واليد والبراعة. ثم لإثارة النهايات العصبية الواردة كهربائيا ، ضع القطب الكهربائي الدائري متحد المركز ذو الميل العمودي على سطح الغشاء المخاطي ويحفز بكثافة عتبة فوق الحدة. ينتج عن هذا تيار ينتشر على نصف قطر ملليمترين.

للعثور على نهايات استقبالية ، حرك القطب الكهربائي بانتظام في خطوات 1.5 ملم على طول وعرض المستقيم المسطح. عندما تكون النهاية الواردة متحمسة ، اضبط موضع القطب وشدة التحفيز لتحديد المجال الاستقبالي الذي يتطلب أقل شدة تحفيز للاستجابة. إذا كانت عتبة التحفيز أكبر من ثلاثة مللي أمبير ، فتخلص من نهاية العصب وانتقل إلى دراسة خيوط عصبية أخرى.

الآن احسب سرعة التوصيل من المسافة بين القطب المحفز في المجال الاستقبالي وموقع التسجيل ، ومن تأخير التوصيل بين قطعة التحفيز وبداية جهد الفعل. بعد تحديد موقع مجال الاستقبال عن طريق التحفيز الكهربائي ، قم بتطبيق ثلاثة محفزات ميكانيكية. أولا ، قم بتطبيق محفز فحص عن طريق الضغط على طرف von fray معاير ، مثل خيوط النايلون الأحادية بشكل عمودي باتجاه المجال الاستقبالي على القولون والمستقيم المسطح.

استخدم الشعيرات الأحادية التي تنتج 0.4 جرام وقوة جرام واحد. ثانيا ، قم بإنتاج حافز التمسيد عن طريق التمسيد برفق للغشاء المخاطي للقولون والمستقيم بخيط خيوط نايلون ناعم ينتج قوة 10 ملليغرام لتوليد إجهاد قص سطحي صغير في المجال الاستقبالي. ثالثا ، قم بإجراء التمدد المحيطي باستخدام مشغل قوة يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر.

اجعلها توفر قوة ممتدة منحدرة في اتجاه محيطي على طول الحافة المضادة للمساريقية للقولون والمستقيم. الآن صنف ENS على أنه غشاء مخاطي عضلي مصلي أو غشاء مخاطي عضلي أو MIAA غير حساس ميكانيكيا. بناء على نتائج الاختبارات الثلاثة.

ابدأ بتسجيل استجابة أساسية لحافز ميكانيكي كما في القسم السابق عن طريق التحقيق الميكانيكي المحيطي أو التمدد أو العمودي لاختبار الحساسية الكيميائية. قم أولا بتغطية الحافة السفلية لقطعة من النحاس أو أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ بالبترول وضعها فوق الحقل الاستقبالي على القولون والمستقيم. الآن قم بشفط محلول كريبس من داخل الأنبوب واستبدل المحلول ب 170 ميكرولتر من محلول الاختبار.

اترك الأنبوب في موضعه لمدة ثلاث إلى خمس دقائق أثناء مراقبة الاستجابات في الوارد. مباشرة بعد إزالة الأنبوب في غضون أربع إلى ست دقائق ، اختبر الاستجابة الواردة لنفس الحافز الميكانيكي كما هو الحال في استجابة خط الأساس. بعد 15 دقيقة أو أكثر ، يمكن اعتبار الكواشف مغسولة.

ثم يتم تطبيق الحافز الميكانيكي مرة أخرى. للمقارنة مع النمل الأساسي ، تم تحفيز العصب المفصل للعثور على مجال استقبال. تم تحديد المجال الاستقبالي من خلال استجابة جهد الفعل باستخدام تأخير التوصيل لجهد الفعل.

سرعة التوصيل المحسوبة نقطة 43 مترا في الثانية ، وهي في نطاق ألياف C غير الميالينية. بعد تحديد المجال الاستقبالي ، تم فحصه بشكل عمودي بواسطة von fray محمول باليد مثل الشعيرات الأحادية ، كما تم مداعبته برفق بواسطة خيوط نايلون ناعمة محمولة باليد. تم أيضا تقييم استجابات AFR للتحقيق بواسطة مشغل قوة يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر والذي يسلم إلى نفس الموقع على القولون والمستقيم ، وهي سلسلة من القوى الميكانيكية الموقوتة بدقة والقابلة للتكرار.

وبالمثل ، تم تسليم التمدد المحيطي للقولون والمستقيم بنفس جهد المشغل. يمكن تمييز الاستجابات بناء على الاستجابات للاستجابات للفحص والتمسيد والتمدد من واردة حساسة للتمدد تم استحضارها من خلال ثلاث امتدادات محيطية متتالية مفصولة بخمس دقائق. تم تثبيت أرقام الارتفاع بشكل متساو وعرضها كوظائف استجابة للتحفيز تكشف عن قابلية عالية للتكرار وحجم الاستجابة وعتبة الاستجابة.

تم تطبيق المواد الكيميائية التالية. حدث التنشيط المباشر ل ens بعد تطبيق محلول مفرط التوتر الحمضي بعد تطبيق حساء التهابي على وارد غير حساس ميكانيكيا. لم يحدث أي تنشيط للنهاية ، ولكن كان اكتساب حساسية meno واضحا.

تم توعية الوارد الحساس للتمدد والحساس بالمينو للتمدد الميكانيكي للمجال الاستقبالي بعد تطبيق حساء التهابي بمجرد إتقانه ، يستغرق الأمر عادة من ثلاث إلى أربع ساعات لإكمال تشريح الأنسجة وتحقيق تسجيل ألياف واحدة. تستغرق التجربة النموذجية يوما كاملا من البداية إلى النهاية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تفهم كيفية إزالة القولون والمستقيم جراحيا وحصاده مع توصيل الأعصاب.

ثم تكون قادرا على التسجيل من ألياف Ahern المفردة إما في العصب الحوضي أو العصب الخشبي القطني ، مما يؤدي إلى تعصيب القولون باستخدام استراتيجية بحث كهربائية غير متحيزة. يجب أن تكون قادرا بعد ذلك على تحديد النهايات المستقبلة في المستقيم واختبارها بحثا عن حساسية الميكانيكا وكذلك الحساسية الكيميائية عن طريق تطبيق المواد الكيميائية مباشرة على النهايات المستقبلة. هذا المستحضر هو إعداد قوي يسمح لك بدراسة الآليات الفيزيولوجية المرضية بالإضافة إلى الأسئلة الفسيولوجية الأساسية في القولون والمستقيم.