في الوقت الحقيقي الكهربية: استخدام البروتوكولات ذات الحلقات المغلقة للتحقيق العصبية حيوية وما بعدها

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء تثبيت ديناميكي في المختبر (in vitro dynamic clamp) في العصبونات القشرية باستخدام مجموعة أدوات البرمجيات المتاحة مجانًا، LCG. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير شرائح من القشرة الحسية الجسدية للجرذ لإجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) من الخلايا الجدارية الموازية (parametal cells). وكخطوة ثانية، يتم تطبيق سلسلة من البروتوكولات الفيزيولوجية الكهربائية المؤتمتة على الخلية المسجلة، مما يوفر توصيفاً معيارياً للخلية يكون مفيداً للتحليلات اللاحقة والمقارنات بين أنواع الخلايا المختلفة.

بعد ذلك، يتم محاكاة حقن الأحداث التشابكية الاستثارية والتثبيطية. ومن أجل إعادة إنشاء حالة الموصلية العالية التي تمر بها العصبونات في القشرة الحديثة في الجسم الحي، تظهر النتائج كيف يقوم حقن التشابكات الخلفية بتعديل كسب الخلايا القشرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية دمج التسجيلات التجريبية في سير عمل أكثر تعقيداً، وذلك عن طريق استخدام نتيجة بروتوكول تجريبي واحد كمدخل لبروتوكول آخر، على سبيل المثال.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في توحيد بروتوكولات الفيزيولوجيا الكهربائية، وتسريع تحليل البيانات، وتمهيد الطريق لمشاركة البيانات بين المختبرات. وبالرغم من أن هذه الطريقة قد طُورت في الأصل لتسجيلات CLA بأسلوب الرقعة (patch) الشامل في المختبر (in vitro)، إلا أنه يمكن استخدامها أيضًا وبسهولة في تحضيرات وبروتوكولات تجريبية أخرى، مثل تسجيلات الرقعة (patch) في الجسم الحي (in vivo)، أو تسجيلات CLA، أو تسجيلات التسريع باستخدام مصفوفات الأقطاب الدقيقة. بعد استخراج دماغ الجرذ، يتم التخلص من المخيخ وفصل نصفي الكرة المخية على طول الخط الناصف باستخدام مشرط، ثم تُزال السوائل الزائدة من أحد نصفي الكرة المخية ويُثبت على منصة مائلة باستخدام قطرة من الغراء القوي.

بعد ذلك، أضف بسرعة بضع قطرات من CSF فوق الدماغ وانقله إلى غرفة Vibram. قم بإزالة أول 2.5 إلى 3 مليمترات من أنسجة الدماغ باستخدام شفرة. بعد ذلك، اضبط سرعة وتردد التقطيع من أجل الحد من تلف سطح الشريحة.

بعد ذلك، اضبط السُمك على 300 micrometers وابدأ في عملية التقطيع. وبمجرد تجاوز الشفرة للقشرة المخية، استخدم شفرة حلاقة أو إبرة منحنية لإجراء قطع فوق الحصين وعند حواف المنطقة القشرية المستهدفة. بعد ذلك، انقل الشرائح إلى غرفة تحضين متعددة الفجوات عند 36 degrees Celsius.

في هذا الإجراء، ضع شريحة في غرفة التسجيل باستخدام عدسة تكبير 40x. ابحث عن خلايا سليمة في الطبقة الخامسة وعلى عمق 600 إلى 1000 micrometers تحت سطح الدماغ؛ وعادةً ما تتميز هذه الخلايا بتباين منخفض، ومظهر أملس، وعدم وجود تورم.

بمجرد العثور على خلية سليمة، املأ ثلث الماصة الدقيقة بالمحلول داخل الخلوي. ثم ضعها في مرحلة الرأس (head stage) في نظام التشغيل Linux المهيأ مسبقاً. قم بتشغيل الأمر.

ستقوم واجهة الأوامر (Shell) بإظهار المطالبة. اكتب هذا الأمر للتأكد من أن لوحة الحصول على البيانات لا تقوم بتشغيل المضخم. بعد ذلك، قم بتطبيق ضغط إيجابي يتراوح من 30 إلى 50 millibars عن طريق الضغط على مكبس السرنجة المتصلة بحامل الماصة.

بعد ذلك، ضع الماصة على ارتفاع 100 micrometers تقريبًا فوق الشريحة، وحرك الماصة نحو الخلية المستهدفة باستخدام وضع الاقتراب في الميكرو-مناور. بعد ذلك، اضبط إزاحة الماصة في مضخم الفيزيولوجيا الكهربائية، وأرسل نبضة اختبار بقيمة 10 millivolt في وضع تثبيت الجهد. استخدم أمر LCG SEAL لمراقبة مقاومة الماصة، ثم قلل الضغط إلى ما بين 10 و 30 millibars عن طريق سحب مكبس المحقنة.

اقترب ببطء من الخلية وتحقق من تكوّن انبعاج عن طريق مراقبة الصورة على شاشة كاميرا الفيديو. وفي الوقت ذاته، راقب الزيادة في المقاومة الناتجة عن نبضة الاختبار من خلال متابعة شكل موجة التيار المعروضة على الشاشة. وعندما تحدث زيادة في مقاومة الماصة ويتكون انبعاج في الخلية، قم بتحرير الضغط فوراً وطبق ضغطاً سالباً خفيفاً على الماصة للمساعدة في تكوين الختم.

وفي هذه الأثناء، قم بخفض جهد التثبيت تدريجياً إلى 70- millivolts. طبق شفطاً خفيفاً لتمزيق غشاء الخلية وتكوين تكوين الخلية الكاملة. بعد ذلك، قم بتوصيف الخلية من حيث خصائصها الكهربائية.

باستخدام رمز LCGE البرمجي. يمثل هذا الرسم متوسط جهد الفعل لعصبون في الطبقة الخامسة من القشرة الجدارية تم تثبيته بطريقة الرقعة، وبقيمة عتبة تبلغ 50.5- millivolts. يوضح هذا الشكل قياس الاستجابات السلبية لتيارات فرط الاستقطاب.

يكشف تحديد الخصائص النشطة الأساسية للخلية أن الخلية عبارة عن عصبون منتظم التذبذب (regular spiking neuron)، مع وجود حد أدنى من التكيف عند حقن جهود استثارة محاكية لما بعد التشابك العصبي، قم بتغيير الدليل الذي سيتم حفظ التجربة التالية فيه عن طريق كتابة هذا الأمر في موجه أوامر الغلاف (shell). بدلاً من التعامل مع عناصر التحكم المادية التقليدية للمضخم. ولتطبيق موازنة الجسر وتعويض السعة، قم بتقدير نواة القطب الكهربائي اللازمة لإجراء تعويض القطب النشط عن طريق إصدار هذا الأمر.

يمثل النواة الكاملة مجموع مكونين: نواة قطب كهربائي سريعة، ونواة غشائية أبطأ تسبب الذيلاً الأسي الملحوظ في النواة الكاملة. وتشكل الأولى نموذجاً غير معلمي للماصة. عند حقن التيار لفصل النواتين الغشائية والقطبية، سيطلب أمر نواة LCG من المستخدم تحديد عدد النقاط التي تشكل نواة القطب الكهربائي السريعة. بعد ذلك، اختر رقماً بحيث تغطي نواة القطب الكهربائي نهاية ذيل الاضمحلال الأسي.

بعد ذلك، قم بإجراء تجربة التثبيت الديناميكي (dynamic clamp) باستخدام هذا الأمر. وأخيراً، قم بتصور النتائج. إليك إعادة محاكاة للنشاط الشبيه بالنشاط داخل الجسم الحي باستخدام التثبيت الديناميكي.

تمثل الآثار الحمراء والزرقاء محاكاة للمشابك العصبية الاستثارة والتثبيطية على التوالي. وهنا تظهر آثار الجهد المسجلة من عصبون في الطبقة الخامسة (L5) في المنطقة الجدارية، والذي خضع لوابل من التيارات التالية للمشبك الاستثارة أو التثبيطية. كما يوضح المخطط التيارات الاستثارة والتثبيطية والكلية المقابلة التي تم حقنها في الخلية.

يوضح مخطط الراستر (raster plot) للنبضات الناتجة عبر 20 تجربة أن العصبون يمكن أن يكون موثوقاً ودقيقاً للغاية في الاستجابة إلى نفس المدخلات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب المصباح الديناميكي باستخدام مجموعة أدوات البرمجيات المتاحة مجاناً LCG. يمكن توسيع هذا الإجراء ليشمل بروتوكولات الحلقة المغلقة الأخرى لاستقصاء مجموعة واسعة من الموضوعات التي تتراوح من الاستثارة العصبية إلى تفاعلات الشبكة المعقدة.