التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي

الهدف العام من التجارب التالية هو فحص الانتشار والسمية المعقدة للبروتينات المشابهة ل PreOn باستخدام الكائن الحي النموذجي Metazoan C. يتم تحقيق ذلك من خلال مراقبة النقل داخل وداخل الخلايا للحويصلات التي تحتوي على البروتين الشبيه ب PreOn ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني. بعد ذلك ، مستشعرات قابلة للطي خاصة بالأنسجة والضغط المعبر عنه في كل مكان.

يتم استخدام المراسلين لتقييم التأثيرات المستقلة للخلايا وغير الخلوية المستقلة على اللياقة الخلوية. ثم يتم إجراء فحص RNAi على مستوى الجينوم من أجل تحديد معدلات جديدة للسمية المستحثة عن PreOn. يتم إجراء الشاشة في الثقافة السائلة باستخدام الضرب كقراءة للسمية.

أخيرا ، يتم استخدام متتبع الدودة ، وهو مكون إضافي للصورة J لتحديد حركة أناقة C معا. تسمح هذه الطرق بتمييز المسارات الجينية المشاركة في الحركة بين الخلايا للبروتينات الشبيهة ب PreOn وسميتها المستقلة غير الخلوية. بعد إعداد التحكم المتزامن في أناقة البحر والخطوط المعدلة وراثيا لمجال PreOn ومنصات agros بنسبة 10٪ ، وفقا لبروتوكول النص المصاحب ، تقوم الماصة بإدخال ثلاثة ميكرولترات من 100 نانوغرام من حبات البوليسترين وثلاثة ميكرولترات من أربعة ملليمولات ليماسول في وسادة agros.

باستخدام سلك بلاتيني ، قم بنقل الديدان في العمر المطلوب من صفيحة إلى المحلول واستخدم زلة غطاء للتغطية لتصوير الديدان على المستوى تحت الخلوي. ضع شريحة في حامل شريحة المجهر في المجهر متحد البؤر واستخدم هدف زيت 63 × أو 100 × 1.4 NA. بعد ذلك ، افتح METAMORPH وحدد اكتساب متعدد الأبعاد.

وضمن علامة التبويب الرئيسية ، حدد المربعات الخاصة بفاصل زمني وتشغيل المجلات. ضمن علامة التبويب الحفظ ، حدد أو قم بإنشاء مجلد الدليل لحفظ الملفات وتعيين اسم للملف ضمن علامة التبويب الطول الموجي ، استخدم Yoko quad red أو إضاءة مكافئة لتصوير MRFP واضبط التعريض الضوئي على ما بين 100 و 300 مللي ثانية وكسب الكاميرا إلى ما بين 100 و 300. بعد ذلك ، ضمن علامة التبويب الفاصل الزمني ، قم بتعيين الفاصل الزمني إلى ثانية واحدة ، والمدة إلى خمس دقائق ، وعدد النقاط الزمنية إلى 301.

ضمن علامة التبويب اليوميات. بالنسبة للدفتر اليومية، حدد مجموعة FC وتعليق Z وإرجاع FC إلى Z للكتابة تحديد خاص مرتين وللنقطة الأولية، حدد بداية النقطة الزمنية ونقطة نهاية الوقت. عند الانتهاء من الإعداد ، اضغط على اكتساب باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل تطبيقات تتبع الجسيمات لقياس الخصائص الديناميكية للدس.

بعد مزامنة مجال البريون المعدل وراثيا وأثناء كتابة الديدان الخيطية ونسخ لوحات مكتبة الحمض النووي الريبي المكررة وفقا لبروتوكول النص ، احتضان لوحات الحمض النووي الريبي المكررة عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة لاستخدام HT واحد 15 بكتيريا الإشريكية القولونية التي تؤوي المتجه الفارغ L 4 4 4 0 كعنصر تحكم. قم بزراعته بشكل منفصل في أنبوب استزراع ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 65 ميكرولترا من المزرعة إلى ربع الآبار 2 96. يتم الاستغناء عن ألواح الآبار مع محطة عمل آلية تحتوي على رأس متعدد القنوات.

10 ميكرولتر من خمسة ، ملي مولار من IPTG المخفف في كل بئر من بكتيريا الحمض النووي الريبي وألواح التحكم. أعد إغلاقها قبل احتضانها لمدة ثلاث ساعات أثناء احتضان البكتيريا. امزج التحكم في النوع البري المتزامن واليرقات المعدلة وراثيا L واحد و M تسعة بئر عازلة وماصة من خمسة إلى 10 ميكرولترات على مجهر زجاجي.

قم بحساب الديدان واحسب عدد الديدان لكل ميكرولتر. بعد الحضانة البكتيرية لمدة ثلاث ساعات ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة لتجنب الضغط على الحرارة للديدان. بعد ذلك ، استكمل المخزن المؤقت M nine بالكوليسترول IPTG والمضادات الحيوية وفقا لبروتوكول النص.

وأضف الحجم المناسب من محلول الدودة المعدلة وراثيا لمجال PreOn إلى التركيز النهائي البالغ 15 دودة لكل مزيج ميكرولتر لتوزيعها بالتساوي. ثم قم بتوزيع 50 ميكرولترا في كل بئر من ألواح الحمض النووي الريبي وآبار إحدى لوحات التحكم في النواقل الفارغة. استغني عن محلول الدودة من النوع البري في لوحة التحكم الثانية.

ثم اترك جميع الألواح غير محكمة الغلق للسماح بالتهوية ومنع المزرعة السائلة من التبخر عن طريق تكديس أربعة إلى خمسة أطباق معا ، ولفها بمنشفة ورقية مبللة متبوعة بورق الألمنيوم. احتضان الألواح عند 20 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة أربعة أيام. بالنسبة لللوحات ، استخدم كاميرا Falcon four M 60 متصلة بجهاز كمبيوتر مزود بشاشة للفحص البصري لزيادة الضرب مقارنة بالحيوانات المعدلة وراثيا في مجال PreOn التي يتم التحكم فيها.

الميزة الرئيسية لاستخدام محطة عمل معالجة السوائل الآلية لتوزيع الديدان في ألواح R RNAi هي أنها تقلل بشكل كبير من التباين وعدد الديدان لكل بئر. لإجراء فحص الحركة على الألواح الصلبة والتحقق من صحة استنساخ الحمض النووي الريبي المرشح ، تنمو بكتيريا الحمض النووي الريبي بين عشية وضحاها وفقا لبروتوكول النص. ثم استخدم IPTG مللي مولار للحث على التعبير عن DS RNA لمدة ثلاث ساعات.

استخدم 150 ميكرولترا من كل استنساخ بكتيري RNAi لزرع ألواح NGM المعدة مسبقا وتنتشر في طبقة رقيقة. اترك البكتيريا تجف لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة في الظلام تحت مجهر استريو. حدد كمية الديدان المتزامنة والمعلقة كما هو موضح سابقا وأضف 25 إلى 30 لترا من يرقة واحدة في كل لوحة تجريبية.

احتضان الديدان الخيطية عند 20 درجة مئوية لمدة أربعة أيام حتى تصل الديدان. اليوم الثاني من مرحلة البلوغ لتحديد حركة الدودة ، قم بتشغيل الكاميرا وبرنامج التصوير PCI البسيط. انقر فوق رمز الكاميرا لتمكين ضبط ظروف التصوير.

بعد ذلك ، قم بإعداد حالة التصوير على النحو التالي. اضبط الكسب على وضع الإضاءة الصفرية إلى مؤشر السرعة العالية إلى واحد والتجميع إلى اثنين. ثم انقر فوق التعريض المباشر والتلقائي واضبط ظروف الإضاءة عن طريق تحريك مرايا المجهر وأقراص السطوع والتباين.

انقر فوق الوقت ، وامسح ضوئيا واكتب في مجلد واسم الملف ، قم بتعيين تأخير الحقل إلى 20 مللي ثانية والتوقف في الوقت المناسب إلى 30 ثانية. اضغط على المراجعة الحية لاختيار منطقة اللوحة المراد تسجيلها. ثم اضغط على اللوحة ثلاث أو أربع مرات على المسرح.

قم بتأكيد موضعه بسرعة في مجال العرض واضغط على ابدأ بعد انتهاء الفيلم من التسجيل ، انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة واختر تصدير تسلسل المونتاج لتصدير الفيلم من تنسيق CXD إلى ملف A VI. لتحليل مقاطع الفيديو الحركية ، افتح الصورة J واختر علامة تبويب المكونات الإضافية ، ثم اختر دودة تعقب وحدد دفعة Worm Tracker ، وحدد الدليل الذي يحتوي على جميع الملفات المراد تحليلها في نافذة الإدخال الرئيسية لدفعة Worm Tracker ، قم بتحميل قيم الإدخال كما هو مفصل هنا. يمكن العثور على شرح لكل معلمة في التعليمات المصاحبة للمكون الإضافي.

انقر فوق موافق واسمح بتشغيل تحليل الحركة. أخيرا ، لتنظيم النتائج ، تأكد من أن جميع المسارات المكتشفة هي من أناقة البحر الفعلية والقضاء على القطع الأثرية. افتح ملفات TXT التي تم إنشاؤها لكل فيلم وانسخ المعلومات إلى ملف برنامج تحليل البيانات.

افتح ملفات التسميات المضغوطة التي تم إنشاؤها وقم بتشغيل التسميات الناتجة TIFF للتحقق يدويا من المسارات الدودية الخاطئة وإزالتها. كان لدى Yesper Peterson ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه السابق في المختبر ، فكرة متتبع الدودة لأول مرة كبديل لتقييمنا اليدوي ل CL Elegance motil ، وهو عبارة عن قراءة للسمية. يسمح لنا متتبع الدودة بإجراء هذه التجارب بطريقة آلية دون تحيز المستخدم أثناء تقييم المزيد من الحالات في فترة زمنية أقصر باستخدام التصوير بفاصل زمني.

شوهد RFP الموسوم R two E two ، والذي يتراكم في حويصلات أنبوبية ، وهو ينتقل داخل الخلايا وبينها بواسطة coex للتعبير عن مستشعر قابل للطي أو مراسل الإجهاد. جنبا إلى جنب مع خلية البروتين المشابهة ل PreOn ، يمكن تقييم التأثيرات المستقلة وغير الخلوية. يؤدي التعبير عن R two E اثنين في خلايا العضلات إلى ظهور مبكر لتراكم Q 44 في الأمعاء ، مما يكشف أن R two E اثنين له تأثيرات مستقلة غير خلوية على البروتين ، والتعبير المشترك ل R two E اثنين مع SOD ثلاثة PGFP يؤدي مراسل الإجهاد التأكسدي النسخي إلى تنظيم المراسل في الأنسجة المختلفة ، مما يدل على أن مجال PreOn يحفز استجابة الإجهاد التأكسدي غير الخلوية بشكل مستقل بعد شاشة الجينوم بأكملها.

يوضح هذا الفيلم أن التصوير والتصور عالي الدقة على شاشة الكمبيوتر يتيح عرض ربع لوحة في وقت واحد بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء بروتوكول الفحص هذا في 12 جولة من 25 لوحة لكل جلسة. إذا تم إجراء جلستين في الأسبوع ، فيمكن فحص مكتبة RNAi بأكملها في غضون ستة أسابيع. تم استخدام متتبع الدودة لتحديد حركة أناقة C كما هو موضح هنا.

Worm Tracker بتحويل مقطع فيديو أصلي إلى تنسيق ثنائي ويتم تعيين مسار لكل دودة. يمكن مشاهدة مقاطع الفيديو التي تمت معالجتها مع المسارات المتراكبة للتخلص من أي قطع أثرية يدويا. يتم تطبيع معلمة أطوال الجسم في الثانية لاختلافات الحجم المحتملة. الديدان الخيطية.

حددت هذه الطريقة 35 مثبطا للسمية المستحثة عن PreOn والتي زادت من النمط الظاهري للحركة إلى 133٪ على الأقل وما يصل إلى 256٪ مقارنة بالديدان المعالجة بالسيطرة. أثناء استئجار متتبع الدودة ، من المهم أن تتذكر التحقق يدويا من الحصول على مسارات الدودة. يقوم البرنامج بعمل رائع في التعرف على الديدان ، ولكن في بعض الأحيان لا يزال من الممكن تحديد الخلفية عن طريق الخطأ على أنها.

لذلك ، تذكر التحقق من مقاطع الفيديو الخاصة بك بعد تشغيل متتبع الدودة عليها. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض التنكسية العصبية مثل ما إذا كان بروتين ارتباط مرض معين قادرا على الانتشار من خلية إلى أخرى ، أو برنس مماثل ، أو ما إذا كان هناك صلة بين الانتقال بين الخلايا والسمية المعقدة لهذه البروتينات. الاطفال.