إعداد وتوصيف SDF-1α-الشيتوزان-ديكستران سلفات النانوية

الهدف العام من التجربة التالية هو إعداد وتوصيف جسيمات SD F1 Alpha Chias و dextran sulfate nanopative. يتم تحضير الجسيمات النانوية عن طريق خلط عامل الخلايا الجذعية الموجه للخلية اللحمية المشتق أولا من عامل ألفا واحد أو S df واحد ألفا مع كبريتات ديكستران للسماح بالارتباط بالجليكان سالب الشحنة. كخطوة ثانية أوزان ، يضاف جليكان موجب الشحنة إلى الخليط لتشكيل مركب بولي إلكتروليت مع كبريتات ديكستران.

بعد ذلك ، تتم إضافة كبريتات الزنك من أجل تثبيت المجمعات بجسور الزنك. يحتوي الجسيم الناتج على نواة كثيفة محاطة بقشرة سالبة الشحنة. يتم قياس الجسيمات لاحقا لحجمها وإمكانات زيتا ، بالإضافة إلى محتوى ونشاط S df واحد ألفا في الجسيمات النانوية الميزة الرئيسية لجسيمات SDF واحدة ألفا جليكان هي أن SDF واحد ألفا مدمج نشط بالكامل دون إطلاقه من الجسيمات.

لذلك ، يمكن أن تكون الجسيمات مفيدة لتكون بمثابة إشارة هيرمين ثابتة في العلاج بالخلايا الجذعية. للبدء ، قم بإعداد محاليل المخزون كما هو موضح في بروتوكول النص وتعقيمها من خلال أغشية مرشح 0.22 ميكرون. تقييم مستويات السموم الداخلية في المحلول المحضر باستخدام مقايسة جل

تأكد من أن المستويات أقل من 0.06 وحدة من السموم الداخلية لكل مليلتر. بعد ذلك عند 0.18 مل من الماء عالي النقاء إلى قارورة زجاجية سعة 1.5 مليلتر تحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي. اضبطي سرعة التقليب على 800 دورة في الدقيقة ، ثم أضيفي 0.1 مل من كبريتات ديكستران 1٪ وقلبي بعد دقيقتين.

أضف 0.08 ملليغرام من SD F1 alpha وحركه لمدة 20 دقيقة. أضف 0.33 مل من 0.1٪ tizen بالقطرة ويحرك لمدة خمس دقائق. قم بتغيير سرعة التحريك إلى الحد الأقصى وأضف ببطء 0.1 مل من كبريتات الزنك باستخدام حقنة غازية محكمة.

أعد سرعة التقليب إلى 800 دورة في الدقيقة وحرك لمدة 30 دقيقة. ثم يضاف 0.4 مل من 15٪ مانيتول ويحرك بعد خمس دقائق. انقل خليط التفاعل إلى أنبوب فوج سعة 1.5 ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 16،000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد الطرد المركزي، قم بشفط المادة الطافية واستخدم ماصة لإزالة آخر قطرة من السائل. أضف ببطء 0.2 ملليلتر من 5٪ مانيتول الحبيبات بحقنة إبرة قياس 0.5 مليلتر 29. ثم أضف ملليلتر إضافيا من 5٪ مانيتول قبل الطرد المركزي.

مرة ثانية في 16,000 GS لمدة 15 دقيقة. بعد تكرار عملية الطرد المركزي لتعليق Resus ، قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 0.2 مل من 5٪ مانيتول. يتم تحليل حجم الجسيمات وإمكانات زيتا عن طريق تشتت الضوء الديناميكي وتشتت الضوء الكهربائي على التوالي.

للبدء ، حدد إجراء عملية من قائمة الإجراءات التشغيلية الموحدة ، والتي تحتوي على معلمات لقياس حجم الجسيمات من خلال تشتت الضوء الديناميكي. كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتخفيف عينة جسيمات ألفا SD F1 بالماء. ثم قم بتحميل 100 ميكرولتر من العينة إلى طبيب بيطري للأشعة فوق البنفسجية يمكن التخلص منه مثل Einor Q Vet.

أدخل الطبيب البيطري Q في حامل الخلية وانتظر حتى يصل ضبط الشدة إلى المستوى الأمثل قبل البدء في الحصول على البيانات. بعد اكتمال القياس ، قم بتسجيل نتائج القطر ومؤشر تشتت بولي. متوسط النتائج التي تم الحصول عليها من كل من القراءات الأربع المتكررة وحساب الانحراف المعياري لقياس جهد زيتا من خلال تشتت الضوء الكهربي.

قم بتحميل 500 ميكرولتر من عينة الجسيمات المخففة عشرة أضعاف إلى خلية التدفق. حدد إجراء عملية من قائمة إجراءات التشغيل التشغيلية القياسية المحتملة Zeta، والتي تحتوي على معلمات للقياس كما هو مدرج في بروتوكول النص. سجل نتائج إمكانات زيتا.

ثم قم بحساب متوسط النتائج التي تم الحصول عليها من كل من القراءات الخمس المتكررة واحسب الانحراف المعياري. قم بتسخين العينات المخففة من SD F1 alpha الحرة والمرتبطة بالجسيمات في عازلة عينة laly عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. دوامة العينات مرتين خلال التسخين لمدة 10 دقائق من أجل فصل الجسيمات تماما بعد تبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، كان لدى أجهزة الطرد المركزي 10 ، 000 Gs لمدة 0.5 إلى دقيقة واحدة لإسقاط دوامة مكثفات الماء مرة أخرى لخلط جيدا.

في هذه المرحلة ، يجب أن يكون محلول العينة واضحا مع عدم وجود راسب مرئي. ثم قم بتحميل 10 ميكرولترات من العينة لكل بئر إلى أربعة إلى 20٪ من كبريتات ESAL الصوديوم أو هلام SDS. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي عند 200 فولت لمدة 20 دقيقة قبل تلطيخ الجل بصبغة بروتين كوماسي الأزرق.

افحص كثافة نطاق البروتين ل SD F1 alpha باستخدام جهاز تصوير جزيئي وبرنامج تحليل قياس الكثافة. احسب كمية S DF واحد ألفا في الجسيمات مقابل منحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام معايير SDF الحرة ألفا لإجراء مزيج فحص الإطلاق في المختبر SD F1 جزيئات ألفا جليكان مع محلول ملحي عازل للفوسفات docos بدون الكالسيوم والمغنيسيوم أو DPBS بنسبة واحد إلى واحد. قسم تعليق الجسيمات إلى 0.05 مليلتر في أنابيب 1.5 ملليلتر.

قم بتحميل العينات في قاع الأنابيب. تجنب إدخال فقاعات الهواء أو إزعاج سطح السائل. ختم الجزء العلوي من الأنابيب مع الطفيل.

ثم قم بتدوير الأنابيب عند 37 درجة مئوية على خلاط أنبوب صغير دوار. قم بإزالة الحصص من الأنابيب في الأوقات المحددة وقم بالطرد المركزي للعينات على الفور عند 16،000 Gs لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية بعد الطرد المركزي. افصل المواد الطافية والكريات.

ثم أعد تكوين الحبيبات مع 0.05 مل من DPBS. بعد جمع جميع العينات ، افحص المواد الطافية والكريات على هلام SDS. كما كان من قبل ، يقيس هذا الاختبار النشاط الكيميائي ل S df.

يتسبب تفاعل ألفا واحد ل S df واحد ألفا مع مستقبله في هجرة الخلية نحو تدرج ألفا SD F1. للبدء في تخفيف شكل SD F1 alpha مع المخزن المؤقت للترحيل في تخفيف تسلسلي ثلاثي الأضعاف إلى التركيزات النهائية المدرجة في بروتوكول النص. أضف 0.6 مل من محلول SD F1 alpha المخفف إلى بئر في لوحة 24 بئر للتحكم السلبي.

افعل الشيء نفسه مع المخزن المؤقت للترحيل فقط ثم أضف 0.57 ملليلتر من المخزن المؤقت للترحيل إلى بئر للتحكم في خلية الإدخال. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم ضع إدراج ثقافة خلية قابلة للاختراق مثل transwell أعلى الحمل السفلي للبئر 0.1 مل من خلايا قبعة النطر في إدراج transwell.

ثم قم بتحميل 0.03 مل من الخلايا مباشرة إلى التحكم في خلية الإدخال. احتضان اللوحة جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد الحضانة ، قم بإزالة إدخالات زراعة الخلايا.

انقل الخلايا التي هاجرت إلى الآبار السفلية إلى أنبوب بوليسترين سعة أربعة ملليلتر. عد الخلايا المهاجرة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. أخيرا ، احسب الترحيل كنسبة مئوية من رقم خلية الإدخال بعد طرح الأرقام في عناصر التحكم السلبية.

يظهر هنا تحليل SD F1 كبريتات ألفا ديكستران قياس حجم جسيمات الأوزان. تظهر نتيجة CUMUL أن القطر الهيدروديناميكي للجسيم هو 671 نانومتر وتشتت بولي 0.24. تظهر لقطة الشاشة هذه أحد القياسات الخمسة المتكررة لإمكانات زيتا لجزيئات الأوزان الخاصة بكبريتات حبلا SD F1 alpha DExT.

جهد زيتا هو سالب 24.7 مللي فولت. يتم تقدير كمية S df واحد ألفا في جزيئات الأوزان S df واحد كبريتات ألفا ديكستران بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام SDS. يظهر هنا جل SDS ملطخ بالكوماسي مع معايير SD F1 ألفا ، وكبريتات ديكستران ، والتحكم في كبريتات كايزان ، وعينات من الجسيمات النانوية SD F1 ، وكبريتات ألفا ديكستران ، وعينات الجسيمات النانوية كايزان.

يتم إنشاء منحنى قياسي من تحليل كثافة حساب نطاقات SD F1 Alpha Standard من المنحنى القياسي إلى أن تركيز S DF واحد ألفا في عينة جسيمات ألفا النانوية SDF هو 0.03 ملليغرام لكل مليلتر. لتحديد معدل الإطلاق في المختبر ل S DF واحد ألفا من الجسيمات النانوية ، تم تحديد كمية S DF المنبعث من ألفا واحد في السوبر وكمية الجسيمات المرتبطة بالجسيمات sdf واحد ألفا في الكريات عن طريق تلطيخ كوماسي لجل SDS متبوعا بتحليل القياس الخلوي. يتم قياس نشاط الجسيم المرتبط بالجسيم S DF واحد ألفا بواسطة مقايسة الهجرة ومقارنتها بذلك ، SDF حر ألفا واحد كما هو موضح هنا.

ال جسيم يقيد [سدف] واحدة ألفا يحث ال نفسه مدى الهجرة بما أن حرة [س] [دف] واحدة ألفا في كل تركيزات يقيس. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يمكن تغيير تركيبة جزيئات بروتين الجليكان. اعتمادا على التطبيق المحدد ، يمكن دمج بروتينات أخرى ويمكن استخدام تركيبات مختلفة لتغيير حجم الجسيمات.

نأمل أن يتم عرض هذا الفيديو على التقنيات الأساسية في إعداد جمع الجسيمات النانوية ثم التحليل الوظيفي ل SDF واحد ألفا المدمج.