سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

الهدف العام من التجربة التالية هو ملاحظة التغيرات في شحنة الغشاء الخلوي بعد الالتصاق بركائز مادية مختلفة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق استزراع الكائنات الحية الدقيقة في وسط غني بالمغذيات لزيادة أعدادها. بعد ذلك، يتم تنظيف أسطح المواد التي ستلتصق بها الكائنات الحية الدقيقة وتفعيلها لضمان تحقيق أفضل معدلات ارتباط ميكروبي.

بعد ذلك، يتم زرع الكائنات الدقيقة على ركائز مادية متنوعة للسماح بالتصوير باستخدام مجهر القوة لمسبار كيلفن أو KPFM. وتُظهر النتائج أن نوع الركيزة المادية وشحنتها المتأصلة لهما تأثير على نشاط الخلايا، كما يظهر من خلال التغيرات في شحنة الغشاء الخلوي والتصاق الخلايا. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الترحيل الكهربائي، وتشتت الضوء، وتحديد نقطة التعادل الكهربائي، في أن تقنية KPFM تسمح بفحص شحنة الخلايا الفردية والأغشية الحيوية بدلاً من المزارع أو المستعمرات بأكملها.

يُعد هذا الأمر مفيداً عند الرغبة في مقارنة الخصائص الكهربائية للخلايا الفردية وكذلك الغشاء الحيوي بدقة وإحكام عاليين. للبدء، قم بتحضير أطباق آغار دم الغنم بنسبة 5%، ثم قم بتخطيط بكتيريا MRSA على الأطباق المحضرة وحضنها لمدة 24 ساعة عند 37 °C لإنتاج مستعمرات منفردة ومعزولة. قم بتحضير 500 milliliters من مرق تريبتيك صويا، مدعماً بـ 1% glucose و 0.1% sodium chloride، ثم قم بتعقيمهما بجهاز الأوتوكلاف، جنباً إلى جنب مع أنبوبي اختبار زجاجيين نظيفين وعلبة من رؤوس الماصات سعة one milliliter.

بعد ترك الوسط وأنابيب الاختبار لتبرد داخل كابينة السلامة الحيوية أو بالقرب من لهب موقد بنزن، اسحب ستة ملليلتر من TSB باستخدام الماصة وضعها في كل أنبوب اختبار. وباستخدام أحد أطباق أغار دم الغنم التي تم تحضيرها مسبقاً، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من MRSA في أحد الأنابيب. استخدم الأنبوب الثاني كعينة ضابطة سلبية لضمان التعقيم، ثم قم بتحضين الأنابيب في حاضنة هزازة تدويرية لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية وبسرعة 200 RPM.

يجب أن يُظهر أنبوب MRSA نمواً، بينما لا ينبغي أن يظهر أي نمو في أنبوب الاختبار الضابط. بعد ذلك، قم بإجراء استزراع فرعي باستخدام 1 mL من المزرعة التي استمرت لمدة 24 ساعة لتلقيح 6 mL من مرق صويا التريبتيك الطازج، ثم حضنها عند 37 °C وبسرعة 200 RPM لمدة ست ساعات أخرى. بعد ذلك، انقل 1 mL من المزرعة باستخدام الماصة إلى أنبوب centrifuge وقم بالطرد المركزي عند 850 ×g لمدة ثلاث دقائق.

تخلص من السائل الطافي واستخدم الماء منزوع الأيونات لغسل الراسب مرتين باستخدام ملقط في اليد المهيمنة. أمسك بقرص عينة FM من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 20 millimeter واستخدم خمسة milliliters من الماء منزوع الأيونات لتنظيف كل جانب. ضع الأقراص النظيفة في بيكر يحتوي على ماء منزوع الأيونات وعرضها للموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة واحدة بعد عملية التنظيف.

استخدم الملقط لإزالة أقراص العينات من الكأس، وأسندها بزاوية 60 درجة تقريبًا مقابل حافة طبق بتري مفتوح فوق منشفة ورقية. ولضمان الجفاف التام، استخدم غطاء الطبق لتغطية الأقراص أثناء التجفيف. وبمجرد جفافها، انقل القرص إلى طبق بتري لعمل وظيفية لسطح القرص. وباستخدام الماصة، ضع من 200 إلى 400 µL من polyol lysine بتركيز 0.1% فوق الأقراص داخل كابينة السلامة الحيوية، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع استخدام الملقط لتثبيت الأقراص.

استخدم الماء منزوع الأيونات لغسلها كما تم توضيحه سابقاً في هذا الفيديو. بعد ذلك، ضع من 200 إلى 400 µL من الخلايا المعاد تعليقها والتي غُسلت مرتين على أقراص العينات المطلية. بعد التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، استخدم بلطف 1 mL من الماء منزوع الأيونات لغسل الأقراص.

اترك الأقراص لتجف طوال الليل قبل التصوير لإجراء تصوير بمجهر القوة لمسبار كلفن. قم بتشغيل الكمبيوتر جنباً إلى جنب مع مجهر القوة الذرية أو AFMs، وHEB ومتحكم MAC three. افتح برنامج تصوير AFM مثل Ulence P ovu overview.

اختر A-C-A-F-M أو التعيين الصحيح للتصوير في وضع التلامس المتقطع. باستخدام ملقط FM في اليد المهيمنة مع إبقاء حامل المشبك المزود بزنبرك مفتوحاً في اليد الأخرى، ضع عارضة A-K-P-F-M بعناية في القطعة الرأسية. قم بتحميل القطعة الرأسية بعناية في A FM وقم بتوصيل أسلاك ضوء الليزر ومحرك رفع المنصة.

بعد ذلك، قم بمحاذاة الليزر على طرف الكابولي (cantilever). ولمحاذاة الليزر على طرف الكابولي، أدر مقبض الضبط الأمامي-الخلفي في اتجاه عقارب الساعة عدة مرات لتحريك الليزر فوق شريحة الكابولي.

عندما يصل الليزر إلى الشريحة، سيتم حجبه ولن يكون مرئياً. بعد ذلك، قم بتدوير مقبض التحريك من الأمام إلى الخلف عكس اتجاه عقارب الساعة حتى تظهر بقعة الليزر مرة أخرى. يكون الليزر الآن على حافة الشريحة.

أدر مقبض التحريك من اليسار إلى اليمين لضبط موضع الليزر على العارضة (cantilever). وعندما يمر الليزر فوق العارضة، سيختفي ثم يظهر مرة أخرى في تتابع سريع. يجب أن تكون بقعة الليزر مرئية في الغطاء الزجاجي المصنفر حيث ستوضع وحدة الصمام الثنائي الضوئي (photo diode unit) لاحقاً.

أدر مقبض التحريك الأمامي-الخلفي عكس اتجاه عقارب الساعة لتحريك البقعة لأسفل العارضة باتجاه الطرف حتى تختفي البقعة من الزجاج المغشى. الآن، أدر مقبض التحريك الأمامي-الخلفي باتجاه عقارب الساعة بشكل طفيف فقط من أجل ضبط وضع الليزر بحيث يستقر تماماً على طرف العارضة، وستظهر بقعة الليزر مرة أخرى على الزجاج المغشى. بمجرد محاذاة الليزر، ثبّت محرك رفع المنصة في الوضع المفتوح لمدة 10 ثوانٍ لضمان وجود مسافة كافية بين العارضة والعينة.

عند تثبيت العينة في جهاز A FM، ضع العينة الآن على منصة KPFM. استخدم سلكاً نحاسياً لتأريض العينة، وقم بتوصيل الأسلاك المناسبة من جهاز A FM إلى منصة العينة. بعد ذلك، قم بتوصيل المنصة بجهاز A FM من خلال برنامج A FM.

تأكد من ألا يتجاوز وقت الضبط 10 milliseconds وألا تتخطى سرعات الاقتراب ميكرونين per second. ولتجنب تلف السن، قم بضبط الكانتيليفر ثم ابدأ بتحريك سن الكانتيليفر باتجاه العينة. وبمجرد وصول سن الكانتيليفر إلى سطح العينة، اختر حجم نافذة التصوير ومنطقة التصوير المثالية، ثم قم بتحسين مكاسب eye و P بالإضافة إلى نقطة ضبط الكانتيليفر لضمان تحسين التصوير الطوبوغرافي.

عندما يتم تحسين التصوير الطبوغرافي، قم بتشغيل وحدة KPFM في وضع FM. اضبط نافذة التصوير على 5 microns في 5 microns بدقة 12 في 12 أو سرعات مسح بطيئة. بالنسبة لإعدادات FM KPFM، اضبط قوة الدفع (drive) بين 5% و10%. اضبط تردد الدفع ليكون بين 1 و5 kilohertz بعرض نطاق ترددي يبلغ 2 kilohertz.

اضبط مكاسب جسيمات الحديد النانوية لـ F-M-K-P-F-M على 0.3%. بعد الحصول على صور KPFM، استخدم برنامج معالجة ما بعد التصوير لتحليل الصور وجمع بيانات SP باستخدام الإعدادات الموضحة في هذا العرض التوضيحي. تم التقاط صور KPFM لـ 15 خلية من MRSA على كل من أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب. تظهر هنا أنواع الصور التي تم جمعها.

نظرًا لأن تقنية KPFM تعمل باستخدام ترددات مزدوجة، فقد تم جمع الصور الطبوغرافية والبيانات الكهربائية لسطح الخلية في آن واحد. وطُبقت مرشحات حرارية على خرائط الجهد السطحي من أجل تمييز التغيرات الطفيفة في الجهد السطحي بسهولة أكبر. وفي هذا الرسم البياني، حُللت الصور لتحديد جهد سطح الغشاء الميكروبي، ثم استُخدمت للمقارنة بين النمو على ركائز مختلفة.

أظهرت عمليات مسح الجهد السطحي لركائز الفولاذ المقاوم للصدأ العارية والذهب العارية جهوداً سطحية سالبة بشكل عام. وأظهرت أقراص الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب المطلية بـ polyol lysine تحولاً نحو جهود سطحية موجبة. وقد تباينت جهود غشاء خلية MRSA بين أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب.

حيث أظهر الفولاذ المقاوم للصدأ جهد سطح غشائي موجب أكبر بكثير للخلايا مقارنة بخلايا MRSA على ركيزة الذهب التي أظهرت جهود سطح سالبة. ولإثبات القدرات الكاملة لتقنية KPFM، يظهر هنا مثال لرسم بياني لارتفاع الدرجة لـ MRSA على الفولاذ المقاوم للصدأ. يوضح هذا الفرق في جهد السطح بين سطح الركيزة والغشاء الميكروبي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مجهر القوة بمسبر كلفن لفحص تأثيرات الشحنة الكهربائية على التصاق الخلايا الميكروبية ونشاطها على أسطح ركائز مادية مختلفة.