سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة التغيرات في شحنة غشاء الخلية بعد الالتصاق بركائز المواد المختلفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الكائنات الحية الدقيقة في وسط غني بالمغذيات لزيادة أعدادها. بعد ذلك ، يتم تنظيف أسطح المواد التي ستلتصق بها الكائنات الحية الدقيقة وتشغيلها للحصول على معدلات التعلق الميكروبية المثلى.

ثم يتم طلاء الكائنات الحية الدقيقة على ركائز المواد المختلفة للسماح بالفحص المجهري لقوة مسبار كلفن أو تصوير KPFM. تظهر النتائج أن نوع الركيزة المادية وشحنتها المتأصلة لها تأثير على نشاط الخلية كما يتضح من التغيرات في شحنة غشاء الخلية والتصاق الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الكهربية وتشتت الضوء وتحديد النقطة متساوية الكهرباء هي أن KPFM يسمح بفحص شحنة الخلايا الفردية والأغشية الحيوية بدلا من الثقافات أو المستعمرات بأكملها.

هذا مفيد عند الرغبة في مقارنة الخصائص الكهربائية للغشاء الحيوي بدقة ودقة عالية. للبدء ، قم بإعداد 5٪ من صفائح أجار دم الأغنام لرسم بكتيريا MRSA على الألواح المحضرة واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية لتوليد مستعمرات مفردة معزولة جيدا. اصنع 500 مل من مرق الصويا ثلاثي الحروف ، مكملا ب 1٪ جلوكوز و 0.1٪ أوتوكلاف كلوريد الصوديوم ، جنبا إلى جنب مع أنبوبين من زجاج نظيف وعلبة واحدة من رشفات ماصة مليلتر واحدة.

بعد السماح للوسيط وأنابيب الاختبار بالتبريد تحت خزانة السلامة الحيوية أو بالقرب من الكعك والموقد ، ضع الماصة ستة ملليلتر من TSB في كل أنبوب اختبار. باستخدام إحدى ألواح أجار دم الأغنام المعدة مسبقا ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من MRSA في أحد الأنابيب. استخدم الأنبوب الثاني كعنصر تحكم سلبي لضمان العقم احتضان الأنابيب في حاضنة متبادلة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.

يجب أن يظهر أنبوب MRSA نموا أو لا ينبغي أن ينمو أي شيء في أنبوب اختبار التحكم. بعد ذلك ، قم بإنشاء ثقافة فرعية باستخدام مليلتر واحد من مزرعة 24 ساعة لتلقيح ستة ملليلتر من مرق الصويا الطازج واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة ست ساعات أخرى. ثم ماصة ملليلتر واحد من المزرعة في أنبوب afus وجهاز طرد مركزي عند 850 مرة G لمدة ثلاث دقائق.

قم بإزالة supinate واستخدام الماء منزوع الأيونات لغسل الحبيبات مرتين بالملقط في اليد المهيمنة. امسك قرصا عينة FM من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 20 ملم واستخدم خمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لتنظيف كل جانب. ضع الأقراص النظيفة في دورق من الماء منزوع الأيونات وصوتنة لمدة دقيقة واحدة بعد الصوتنة.

استخدم الملقط لإزالة أقراص العينة من الدورق وقم بإمالتها بزاوية 60 درجة تقريبا على حافة طبق بتري مفتوح على منشفة ورقية لتجف تماما ، استخدم غطاء الطبق لتغطية أقراص التجفيف. بمجرد أن يجف ، انقل القرص إلى طبق بتري لتشغيل سطح القرص. ماصة 200 إلى 400 ميكرولتر من 0.1٪ بوليول ليسين على الأقراص في خزانة السلامة الحيوية ودرجة حرارة الغرفة المحتضنة لمدة ساعة واحدة باستخدام ملقط لتثبيت الأقراص.

استخدم الماء منزوع الأيونات لغسلها كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. اللوحة التالية ، 200 إلى 400 ميكرولتر من الخلايا المعلقة التي تم غسلها مرتين على أقراص العينة المطلية. بعد احتضان درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، استخدم ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات برفق لغسل الأقراص.

اترك الأقراص تجف طوال الليل قبل التصوير لإجراء التصوير المجهري Kelvin Probe Force. قم بتشغيل الكمبيوتر مع مجهر القوة الذرية أو وحدة التحكم الثلاثة AFMs و HEB و MAC. افتح برنامج تصوير A FM مثل نظرة عامة على Ulence P ovu.

حدد A-C-A-F-M أو التعيين الصحيح للتصوير في وضع التلامس المتقطع. باستخدام ملقط FM في اليد المهيمنة وفتح حامل المشبك المحمل بنابض في اليد الأخرى ، ضع ناتئ A-K-P-F-M بعناية في غطاء الرأس. قم بتحميل غطاء الرأس بعناية في A FM وقم بتوصيل ضوء الليزر وأسلاك محرك رفع المسرح.

ثم قم بمحاذاة الليزر على طرف الكابولي. لمحاذاة الليزر على طرف الكابولي. قم بتدوير المقبض الأمامي إلى الخلفي في اتجاه عقارب الساعة عدة مرات لتحريك الليزر أعلى شريحة الكابولي.

عندما يصل الليزر إلى الشريحة ، سيتم حظره ولن يكون مرئيا بعد الآن. ثم قم بتدوير المقبض الأمامي إلى الخلفي عكس اتجاه عقارب الساعة حتى تظهر بقعة الليزر مرة أخرى. الليزر الآن على حافة الشريحة.

قم بتدوير المقبض من اليسار إلى اليمين لوضع الليزر على الكابولي. عندما يمر الليزر فوق الكابولي ، سيختفي ويظهر مرة أخرى في تتابع سريع. يجب أن تكون بقعة الليزر مرئية في الغطاء الزجاجي المصنفر حيث ستجلس وحدة الصمام الثنائي للصور لاحقا.

أدر المقبض الأمامي إلى الخلفي عكس اتجاه عقارب الساعة لتحريك البقعة أسفل الكابولي باتجاه الحافة حتى تختفي البقعة الموجودة على الزجاج المصنفر. الآن أدر المقبض الأمامي إلى الخلفي في اتجاه عقارب الساعة قليلا فقط من أجل وضع الليزر بحيث يجلس على طرف الكابولي فقط ، وستظهر بقعة الليزر مرة أخرى على الزجاج المصنفر. بمجرد محاذاة الليزر ، أمسك محرك رفع المسرح في وضع الفتح لمدة 10 ثوان لضمان مساحة كافية بين الكابولي والعينة.

عند إرفاق العينة ب A FM ، ضع العينة الآن على مرحلة KPFM. استخدم الأسلاك النحاسية لتأريض العينة وتوصيل الأسلاك المناسبة من A FM بمرحلة العينة. ثم قم بتوصيل المسرح ب A FM في برنامج A FM.

تأكد من أن وقت الإعداد لا يزيد عن 10 مللي ثانية وأن سرعات الاقتراب لا تتجاوز ميكرونين في الثانية. لتجنب تلف الطرف ، قم بضبط الكابولي وابدأ في تحريك طرف الكابولي نحو العينة. بمجرد وصول طرف الكابول إلى سطح العينة ، حدد حجم نافذة التصوير ومنطقة التصوير المثالية ، وقم بتحسين مكاسب العين و P جنبا إلى جنب مع نقطة ضبط الكابول بحيث يتم تحسين التصوير الطبوغرافي.

عند تحسين التصوير الطبوغرافي، قم بتشغيل وحدة KPFM في وضع FM. اضبط نافذة التصوير على خمسة ميكرون × خمسة ميكرون بدقة خمسة 12 × خمسة 12 أو سرعات مسح بطيئة. بالنسبة لإعدادات FM KPFM ، اضبط محرك الأقراص بين خمسة و 10٪ اضبط تردد محرك الأقراص على ما بين كيلو هرتز وخمسة كيلو هرتز بعرض نطاق ترددي يبلغ كيلو هرتز.

اضبط مكاسب NP الحديدية ل F-M-K-P-F-M على 0.3٪ بعد الحصول على صور KPFM ، استخدم برنامج معالجة ما بعد التصوير لتحليل الصور وجمع بيانات SP باستخدام الإعدادات الموضحة في عرض الفيديو هذا. تم التقاط صور KPFM على 15 خلية MRSA على كل من الأسطح المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب. تظهر هنا أنواع الصور التي تم جمعها.

نظرا لأن KPFM يعمل باستخدام ترددات مزدوجة ، فقد تم جمع الصور الطبوغرافية والبيانات الكهربائية لسطح الخلية في وقت واحد. تم تطبيق المرشحات الحرارية على خرائط الجهد السطحي من أجل تمييز التغيرات الصغيرة في إمكانات السطح بسهولة أكبر. في هذا الرسم البياني ، تم تحليل الصور لتحديد إمكانات سطح الغشاء الميكروبي ، ثم استخدامها للمقارنة للنمو على ركائز مختلفة.

أظهرت عمليات المسح المحتملة السطحية للركائز المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ العاري والذهب العاري إمكانات سطحية سلبية بشكل عام. أظهر كل من الفولاذ المقاوم للصدأ المطلي بالبوليول ليسين وأقراص الذهب تحولا إلى إمكانات السطح الإيجابية. اختلفت إمكانات غشاء الخلايا MRSA بين أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب.

مع عرض الفولاذ المقاوم للصدأ إمكانات سطح غشاء إيجابية أكبر بكثير للخلايا مقارنة بخلايا MRSA على الركيزة الذهبية التي أظهرت إمكانات سطحية سلبية. لإثبات القدرات الكاملة ل KPFM ، يظهر هنا مثال على الرسم البياني لارتفاع الخطوة ل MRSA على الفولاذ المقاوم للصدأ. يوضح هذا الفرق في إمكانات السطح بين سطح الركيزة والغشاء الميكروبي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفحص المجهري لقوة مسبار كلفن لفحص تأثيرات الشحنة الكهربائية على ارتباط الخلايا الميكروبية ونشاطها على أسطح الركيزة المادية المختلفة.