النمذجة 3D من جانبي البطينات ونسيجية توصيف الأنسجة المحيطة بالبطين في البشر والفأر

الهدف العام من الإجراءات التالية هو توفير وسيلة للسماح بالتحقيقات في سبب وتأثير ماغالي البطين وتسليط الضوء على التقنيات التي تسمح بدراسة صحة الجهاز البطيني وحاجزه المهم ووظائف الترشيح داخل الدماغ. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الأقسام الإكليلية من دماغ الفأر أو فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ البشري لتوليد عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للبطينين وحساب أحجام البطين كخطوة ثانية ، يتم تلطيخ أنسجة ما بعد الوفاة التي تتضمن مستحضرات en foss للسطح القمي للبطينين بأجسام مضادة خاصة بالخلايا للكشف عن السلامة الخلوية لبطانة البطين. بعد ذلك ، يتم إعداد مونتاج للتنظيم الخلوي على سطح البطين بالكامل وتقديمه عبر النموذج ثلاثي الأبعاد للبطين لإظهار مناطق الدبقي مقابل الخلايا الملحقة السليمة.

تظهر النتائج مناطق تمدد البطين بناء على النمذجة ثلاثية الأبعاد الطولية للبطينين والمناطق التي لم تعد فيها طبقة الخلية الملحقة ببطانة البطين سليمة ، ولكن تم استبدالها بندوب دبقية. من خلال الجمع بين بيانات النمذجة ثلاثية الأبعاد والبيانات الكيميائية المناعية ، يمكن إنشاء خريطة محددة لمنطقة ثلاثية الأبعاد للتركيب الخلوي لبطانة البطين. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص إصابات الدماغ والأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر والشيخوخة الطبيعية ، وكلها تظهر عادة مستوى معينا من تمدد البطين وبالتالي الجنف السطحي البطيني المحتمل.

توضيح الإجراءات في الفأر ريتشارد وولفر والطالب الجامعي من إجراءاتنا المختبرية التي يتم إجراؤها باستخدام بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي البشري وسيتم عرض الأنسجة البشرية بعد الوفاة بواسطة يون. حاليا طالب طب وريبيكا تشو ، طالبة دراسات عليا في المختبر. قم بإعداد الشرائح المراد تصويرها عن طريق إصلاح التقسيم والتلوين المناعي وتركيب دماغ الفأر كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول لبدء الإجراء ، لتتبع البطينين الجانبيين للفأر ، وتشغيل المجهر الفلوري المستقيم والكمبيوتر ، يجب أن يكون المجهر مزودا بمرحلة آلية وكاميرا CCD رقمية.

قم بتشغيل برنامج رسم الخرائط في وضع التألق ، وافتح خيارات العرض لتحميل أشرطة الأدوات ولوحات تجمع الإرساء اللازمة للتتبع. انقر بعد ذلك على خيارات وملحقات خيارات العرض وحدد أشرطة الأدوات الرئيسية والعلامة في نفس القائمة. ضمن لوحات تجمع الإرساء، حدد الرسم البياني للكاميرا والتحكم متعدد القنوات وإعدادات الكاميرا والحصول على الصور.

حدد القطعة الأولى من الأنسجة التي تحتوي على البطينين الجانبيين بناء على مضان بيتا القوي S 100 الذي يصنف الخلايا الملحقة. بطانة البطين الجانبي. قم بتوجيه نصفي الكرة الأيسر والأيمن من خلال تحديد الشق الصغير الذي تم إجراؤه أثناء التقطع.

الآن قم بإنشاء ملف بيانات جديد وقم بتعيين نقطة مرجعية لحركة المسرح من خلال النقر في نافذة الصورة أعلى البطين الجانبي الأيسر. احتفظ بهذه النقطة المرجعية في موقع متسق بالنسبة للبطينين الجانبيين عبر ملفات التتبع. للمساعدة عند استيراد الخطوط لإعادة البناء التسلسلي، حدد نوع الكنتور المحدد مسبقا المناسب من القائمة المنسدلة Contour.

استخدم لونا فريدا لكل من تتبع البطين الجانبي الأيمن والأيسر. انقر الآن على طول السطح القمي بالكامل لبطانة الملحق لتتبع محيط البطين. حرك نافذة التتبع باستخدام مفاتيح الأسهم.

بعد تتبع المحيط ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد إغلاق المحيط. كرر تتبع البطين الأيمن باستخدام لون مختلف. بعد ذلك ، حدد العلامة المناسبة من شريط أدوات العلامات على اليسار ، وانقر لإسقاط علامة على شاشة التتبع على طول خط الوسط للمساعدة في محاذاة الخطوط التسلسلية لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد.

كرر هذا الإجراء لعمل علامة ثانية. احفظ آثار الأنسجة عن طريق تحديد ملف حفظ ملف البيانات باسم وإنشاء مجلد جديد ورقم اسم الملف ، ورقم التتبع وفقا لرقم الشريحة النموذجي ، ورقم الأنسجة ، لسهولة التعرف على الآثار من الأقسام التسلسلية. ثم كرر الإجراء الموضح للتو لجميع الأقسام التي تحتوي على بطانين.

لإجراء إعادة بناء البطين الجانبي 3D. افتح برنامج إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. ثم انقر فوق ملف افتح وحدد ملف كنتور القسم التسلسلي الأول للتتبع.

قم باستيراد جميع التتبع المحيطي للبطين الأيسر والأيمن ، بالإضافة إلى أي علامات مضافة. قم بمحاذاة الخطوط وفقا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكول. ثم حدد جميع الخطوط في اللوحة اليسرى ، ثم انقر فوق الزر 3D visualization لعرض إعادة البناء ثلاثية الأبعاد النهائية.

تظهر هذه الصورة قسم دماغ الفأر الإكليلي بما في ذلك البطينين الجانبيين الموضحين بواسطة خلايا الملحق المناعي S 100 beta. تشير العلامة النجمية إلى البطينين الجانبيين. تحدد الأقواس الالتصاق ويمثل شريط المقياس 500 ميكرون.

يتم تتبع البطينين الجانبي للفأر كملامح وترتيبها كأقسام فرعية. يتم التخلص من مناطق داخل البطين من التدخل في التحليل الحجمي. تظهر هذه الصورة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد النهائية لملامح البطين الجانبي.

يمثل اللون الأصفر محيط أحجام الدماغ بأكملها التي تمتد على منطقة الاهتمام التي تحتوي على البطينين الجانبيين. يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء إعادة بناء البطين ثلاثية الأبعاد لأنسجة المخ المقطعة من كورونا يتم سرد البروتوكولات لإنشاء إعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد والقياس الكمي الحجمي للبطينين الجانبيين ولتقييم التغيرات الحجمية بمرور الوقت باستخدام تحليل التراكب الطولي ، من المهم ملاحظة هذا الاتساق في التصوير بالرنين المغناطيسي. يعد جمع بيانات R ومعالجة ما بعد الاستحواذ من المعايير المهمة للغاية لإدراج مجموعات البيانات لإجراء تجزئة البطين ، يتم استخدام ITK SNAP لتقسيم البطينين من صور MR المرجحة T One عالية الدقة. بعد بدء تشغيل البرنامج ، افتح الصورة ذات التدرج الرمادي ، وحدد الملف المطلوب وافتحه كملف أنيق.

ثم قم بالتمرير عبر كل مستوى تشريحي ولاحظ تشوهات البطين مثل مناطق الأنف أو القرون الصدغية الكبيرة أو الصغيرة أو ما شابه ذلك. بعد ذلك في مربع الأدوات الرئيسي ، انقر فوق ثعبان ، أداة عائد الاستثمار. ثم قم بتقسيم 3D وحدد خيار منطقة الشدة.

الآن انقر فوق صورة ما قبل المعالجة وحدد أعلاه. سجل أقصى كثافة باستخدام الشريط المنزلق. ثم اضبط العتبة على 15٪ من الحد الأقصى للكثافة وسجل هذه القيمة.

يجب أن يسلط هذا الضوء على عائد الاستثمار باللون الأبيض. اضبط معلمة النعومة على 10. انقر فوق موافق.

ثم التالي. بعد ذلك ، أضف 10 إلى 12 فقاعتين صغيرتين الحجم لكل بطين. اثنان في القرن الأمامي الأمامي ، وسبعة متباعدة بشكل متساو على طول السطح العلوي لجسم البطين الجانبي ، وواحد في القرن القذالي والآخر في القرن الصدغي للبطين الجانبي.

بعد ذلك ، حدد المعلمات واضبط قوة الانحناء على 0.4. ثم انقر فوق رمز التشغيل لبدء تطور الكفاف النشط. الآن انقر فوق تحديث الشبكة لتصور السطح.

ثم تحقق من التحديث التلقائي. أوقف عملية التجزئة عندما يتم تضمين جميع مناطق البطين الجانبي في المنطقة المعنية. تجنب إدراج البطين الثالث.

أخيرا ، انقر فوق إنهاء واحفظ نتائج التجزئة كتنسيق ملف أنيق. للحصول على الحجم الكلي للبطين ، حدد التجزئة والحجم والإحصائيات للحصول على الحجم الكلي للبطين باستخدام تعيين تسمية اللون. في هذا الجزء ، يتم تراكب عائد الاستثمار الطولي باستخدام برنامج المانجو لإظهار التغيرات في حجم البطين نوعيا وكميا داخل الأشخاص بمرور الوقت.

بعد فتح البرنامج ، انقر فوق فتح ، افتح ملف تحميل الملف المحفوظ مسبقا. بعد تحميل ملف الصورة، انقر فوق عائد الاستثمار لتحميل الملف وقم بتحميل عائد الاستثمار للنقطة الزمنية الأساسية لعائد الاستثمار باللون الأخضر. انقر فوق عائد الاستثمار لتحميل الملف وقم بتحميل النقطة الزمنية الثانية لعائد الاستثمار باللون الأحمر.

احفظ التراكب الطولي عن طريق تحديد عائد استثمار حفظ الملف ، وقم بتعيين اسم ملف لكل صورة وفقا للاصطلاح المعروض الآن على الشاشة. بعد ذلك ، افتح ITK snap. ثم أعد فتح عائد الاستثمار المدمج كعائد استثمار مدمج لتحميل صورة بمقياس رمادي عن طريق تحديد حمل التجزئة من ملف عائد الاستثمار المدمج للصورة للحصول على بيانات وحدة التخزين الطولية، وتشغيل حجم التجزئة والإحصائيات التالية.

تسمية واحدة باللون الأحمر يساوي تسمية حجم التمدد اثنين أخضر يساوي تسمية حجم التضيق ثلاثة أزرق يساوي الحجم الأساسي ، بدءا من نصف الكرة الأرضية السليم الذي تم تثبيته في 10٪ فورمين لمدة ستة أسابيع كحد أقصى وشطفه جيدا بشريحة 0.1 مولار PBS ، وأقسام إكليلية بسمك 1.5 سم عبر نصف الكرة الأرضية بأكمله باستخدام سكين كبير باستخدام مشرط جراحي مجهري. قم بتشريح جدار البطين بعمق سنتيمتر واحد ، مع الحفاظ على قسم واحد مستمر للجدار الجانبي بأكمله ، وقسم الجدار حسب الحاجة لإنشاء أقسام ذات حجم مناسب للتلطيخ. حسنا ، قم بشق القسم الموجود على الجانب الآخر من جدار البطين.

لتحديد الاتجاه السفلي المتفوق ، قم بإجراء كيمياء المناعية وتركيب الأقسام وفقا للبروتوكول المكتوب. تحت نطاق تشريح ، قم بتأمين الأنسجة باستخدام دبابيس بسكين طعنة جراحية مجهرية ، وقم بإنشاء قسم رفيع بشكل موحد من جدار البطين الجانبي وقم بتركيب قلم جانبي على شريحة عندما تجف الشرائح تماما ، افحص الأقسام عن طريق المجهر متحد البؤر المناعي. اضبط المستوى البؤري للتصوير على سطح البطين على النحو الذي يحدده استخدام بيتا كاتينين ، وهي علامة للالتصاق القمي.

بروتينات التوصيل لخلايا الإلحاق. ثم حدد مناطق تغطية الخلية الملحقة والانبساط الفلكي السطحي وفقا لتلوين GFAP على سطح البطين لتوثيق ومونتاج سطح البطين بالكامل. استخدم صورا متداخلة للسطح بأكمله لإنشاء مونتاج للصور التسلسلية.

افتح Adobe Photoshop واستخدم أتمتة الملفات تلقائيا للظهور تخطيط تفاعلي لتحديد الصور للتراكب ، وإجراء تعديلات يدوية إذا لزم الأمر. قم بإنشاء طبقة جديدة لتتبع المونتاج لإنشاء تمثيل كرتوني سليم. تعتمد على تغطية الخلايا أو الجنف G على سطح البطين ، وقم بتجميع جميع الأقسام لإعادة بناء خريطة جدار البطين وربطها بالمنطقة المقابلة في إعادة بناء التصوير بالرنين المغناطيسي.

هذا هو تجميع صور التصوير بالرنين المغناطيسي البشري هنا. تم تعريف البطين الجانبي على أنه منطقة الاهتمام باللون الأحمر. تسمح إعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد كما هو موضح هنا بالقياس الكمي الحجمي والتصور النوعي للبطين الجانبي.

توضح هذه الصورة تقييم تمدد البطين الطولي لدى مريض مسن. يمكن محاذاة التصوير بالرنين المغناطيسي الطولي من نقاط متعددة وتراكبها لتصور وقياس توسع حجم البطين داخل الأهداف بمرور الوقت. تظهر هذه الصور الثلاث الأخيرة التقييم الكيميائي المناعي ورسم الخرائط الإقليمية لسطح البطين الجانبي البشري. هنا.

تظهر مناطق الخلايا الملحقة السليمة التي حددها بيتا كاتين والتلوين مظهرا مرصوفا بالحصى كما هو موضح في علامة النجمة ويتم ترسيمها بخط منقط من مناطق الدبقي الفلكي على سطح البطين المبين بواسطة تلطيخ GFAP. يتم تراكب الصور متحدة البؤر التسلسلية لإنشاء مونتاج إقليمي وتتبعها باستخدام Adobe Photoshop أو تمثيل كرتوني للتنظيم الخلوي على سطح البطين. تم تعيين هذه الصورة الكرتونية للمونتاج على سطح البطين على إعادة بناء البطين ثلاثي الأبعاد القائم على التصوير بالرنين المغناطيسي.

كما هو موضح ، يشير اللون الأخضر إلى ملحق سليم ومناطق حمراء من الدبقة. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على توثيق دقيق لكل عينة من الأنسجة من أجل إجراء إعادة البناء التسلسلي ورسم خرائط السلامة الخلوية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التجزئة الفرعية للبطينين الجانبيين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتوسع الخاص بالمنطقة بمرور الوقت.